參麥注射液對高血壓心衰大鼠血漿代謝組學的影響

鐘森杰　李欣春　李琳　胡志希　簡維雄　周瑤　姚濤　楊夢

〔摘要〕 目的 研究參麥注射液對高血壓心衰大鼠血漿代謝組學的影響。方法 通過8%NaCl高鹽飼料喂養Dahl鹽敏感性大鼠制造高血壓心衰模型，成模大鼠分為模型組、參麥注射液組，并同時設置正常組，干預15 d后，采集正常組、模型組和參麥注射液組大鼠的血漿樣本，運用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術及多元統計分析進行研究。結果 3組的代謝圖譜存在顯著差異。與正常組相比，模型組19種代謝物水平紊亂;經參麥注射液干預后，亮氨酸、鳥氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、蘇糖醇、丙酮酸、尿素濃度向正常方向顯著回調，蘇糖酸、半胱氨酸、色氨酸、甲基半胱氨酸、花生四烯酸、膽固醇、木糖醇、核糖醇、焦谷氨酸、丙二酸濃度無顯著改變，此外還發現異亮氨酸濃度上升。結論 高血壓心衰大鼠血漿代謝組學出現變化，參麥注射液能有效改善部分紊亂的代謝物水平，其作用機制與改善糖代謝、氨基酸代謝紊亂，調節支鏈氨基酸水平相關，未發現有改善脂代謝紊亂的作用。

〔關鍵詞〕 心力衰竭;高血壓;參麥注射液;代謝組學

〔中圖分類號〕R285.5;R541.3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.004

Effects of Shenmai Injection on Plasma Metabolomics in Rats with Hypertensive Heart Failure

ZHONG Senjie1， LI Xinchun2， LI Lin1， HU Zhixi1*， JIAN Weixiong1*， ZHOU Yao1， YAO Tao1， YANG Meng1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Changsha Jinrun

Hospital of TCM， Changsha， Hunan 410014， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Shenmai Injection on plasma metabolomics in rats with hypertensive heart failure. Methods The hypertensive heart failure model was established by continuously feeding Dahl salt-sensitive rats with 8% NaCl diet. After modeling， the rats were randomly divided into model group， Shenmai Injection group and normal group. After 15 d of intervention， plasma samples of the normal group， the model group， and the Shenmai Injection group were collected， and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） coupling technique and multivariate statistical analysis were applied for the study. Results There were significant differences in metabolic patterns of the 3 groups. Compared with the normal group， there were disorders in the levels of 19 metabolites in the model group; the concentrations of leucine， ornithine， alanine， 4-hydroxy-proline， threonine， asparagine， threitol， pyruvic acid and urea intervened by Shenmai Injection were significantly back-regulated towards the normal level， and there were no significant differences in the concentrations of threonic acid， cysteine， tryptophan， methyl cysteine， arachidonic acid， cholesterol， xylitol， ribitol， pyroglutamic acid and malonic acid. In addition， it was found that the concentration of isoleucine was increased. Conclusion The changes of plasma metabolomics in heart failure rats with hypertension indicates that Shenmai Injection can effectively improve the levels of some disordered metabolites. The mechanism of Shenmai Injection is related to the improvement of disorders in glucose metabolism and amino acid metabolism， and the regulation of the levels of branched chain amino acid， but no improvement of lipid metabolism disorder is found.

〔Keywords〕 heart failure; hypertension; Shenmai Injection; metabolomics

心衰是各種心臟疾病的終末期，具有并發癥多、致死率高的特點，為21世紀最重要的慢性心血管病癥[1]。高血壓病作為常見的心血管疾病，是心衰的高危因素，最新臨床流行病學調查[2]顯示：男性39%和女性59%的心衰發生可歸因于高血壓。高血壓患者由于血壓長期增高，導致血管壁、心臟壓力負荷增大，引起血管平滑肌增生及心肌纖維化等一系列病理變化，最終導致心臟等靶器官損害，收縮和舒張功能降低，從而引發心衰[3-4]。

前期研究發現，參麥注射液能有效改善高血壓心衰大鼠的心功能、血流動力學指標和心肌組織形態，展現出良好的治療效果[5]。本實驗利用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術及多元統計分析，從生物學角度探討參麥注射液治療心衰的作用機制，為心衰的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

雄性Dahl鹽敏感性大鼠25只，體質量（220±10）g，北京維通利華實驗動物有限公司提供（合格證編號：11400700134072），湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室內飼養。

1.2? 主要藥物與試劑

主要藥物：參麥注射液（規格：20 mL/瓶），杭州正大青春寶藥業公司生產（批號：1402225）。

主要試劑：甲醇（沃凱，上海）;2-氯苯丙氨酸（Aladdin，美國）;十七碳酸（Aladdin，美國）;甲氧基胺鹽酸鹽（TCI，日本）;衍生化試劑（含1%三甲基氯硅烷的BSTFA試劑，日本TCI公司提供）。

1.3? 主要儀器設備

Forma 900系列超低溫冰箱（Thermo，美國）;7890A型氣相色譜儀、5975C型質譜儀（Agilent，美國）;BP-2010A型智能無創大鼠血壓計（Softron，北京）;QL-866型混勻儀（Vortex Mixer，美國）;SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀（開立，深圳）;H1650-W型冷凍離心機、53050型真空濃縮儀（Eppendorf，德國）。

1.4? 動物模型制備

1.4.1? 造模方法? 隨機選取8只大鼠為正常組，其余均為造模組。根據課題組文獻報導的方法[6]研制高血壓心衰大鼠模型，正常組予0.3%NaCl低鹽飼料喂養，造模組予8%NaCl高鹽飼料喂養，喂養20周。

1.4.2? 模型評價? 每15天測量一次大鼠鼠尾血壓，發現造模組自喂食高鹽飼料后，其鼠尾血壓一直大于140 mmHg，確定已成高血壓模型;而正常組血壓基本維持在140 mmHg以下，尚未達到高血壓診斷指標，難以構成心臟器質性病變。喂養20周后，造模組大鼠死亡2只，對兩組大鼠進行超聲心動圖檢查和血清氨基末端腦鈉肽前體（N Terminal-pro brain natriuretic peptide， NT-proBNP）含量檢測，發現與正常組相比，造模組左心室射血分數（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左室短軸縮短率（fraction shortening， FS）、NT-proBNP含量均有顯著差異，具體見表1。參照本課題組的文獻報導[5-6]，評定造模組大鼠模型成立。

1.5? 分組給藥

造模成功大鼠15只，按隨機數字表法分為模型組（7只）和參麥注射液組（8只）。經過人與動物等效劑量換算（人體質量60 kg），參麥注射液組的每次給藥劑量為6.0 mL/kg，每天1次，通過腹腔注射方式給藥，給藥15 d。

1.6? 血漿樣本采集

對所有大鼠進行腹主動脈取血，取血完畢后常溫靜置20 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，提取上清液，保存于-80 ℃冰箱中。

1.7? GC-MS檢測

實驗時將所有樣本在4℃下融化，每個樣本各取100 ？滋L于1.5 mL離心管，進行預處理：（1）加入400 ？滋L甲醇，振蕩60 s;（2）加入內標（60 ？滋L 2-氯苯丙氨酸、60 ？滋L十七碳酸），渦旋振蕩60 s;（3）4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液至新離心管中，并用真空離心濃縮儀濃縮。

完成上述步驟后，對樣本進行衍生化處理。GC-MS適用于檢測揮發性較好的代謝物，對于含有羧基、羥基、氨基等的代謝物，可以通過衍生化的方法增加其揮發性。具體步驟如下：（1）肟化處理：加入60 ？滋L甲氧基溶液，渦旋振蕩30 s，37 ℃反應2 h;（2）硅烷化處理：加入60 ？滋L衍生化試劑，37 ℃反應90 min;（3）4 ℃、12 000 r/min離心10 min，提取上清液，進行GC-MS檢測。

GC-MS條件：氣相色譜采用HP-5MS毛細管柱以1 mL/min的恒流氦氣來分離衍生化物質，1 ？滋L樣品以分流比20∶1的方式通過自動進樣器注入。注射溫度為280 ℃，接口設置為150 ℃和離子源調整到230 ℃。升溫程序以60 ℃為初始溫度，持續2 min，以10 ℃/min的速率上升到300 ℃，并在300 ℃停留5 min。質譜采用的是范圍從35～750 m/z的全掃描方法。

1.8? 數據預處理

GC-MS分析后得到可供生物信息學分析的原始數據，通過G1701 MSD ChemStation軟件將數據轉為netCDF格式（xcms輸入文件格式），利用R（v3.1.3）的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊，獲得包括質核比、保留時間及峰面積等信息的數據矩陣。參照NIST商業數據庫和Wiley Registry代謝組數據庫，結合AMDIS程序注釋代謝物。

1.9? 統計分析方法

應用SIMCA-P（v13.0）軟件，組間模式識別采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），根據結果構建相應的得分圖。差異代謝物的篩選采用正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據OPLS-DA模型的VIP值（第一主成分變量重要性值），結合單因素方差分析的P值，以VIP值>1且P<0.05為條件進行篩選。

2 結果

2.1? GC-MS分析

3組大鼠GC-MS代表性總離子流色譜圖（Total lon chromatography， TIC）如圖1所示。將各組TIC導入數據庫選擇出匹配度較好的內源性代謝物85種，進行后續的多元統計分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）。

2.2? 模式識別

通過PCA和PLS-DA分析后，得到相應的得分圖，見圖2。得分圖中每一點代表一個樣本的代謝成分積分點，越靠近的樣本點，表明兩者之間代謝差異越小;越遠離的樣本點，表明兩者之間代謝差異越大。PCA得分圖和PLS-DA得分圖顯示3組的樣本點雖有交叉點，但仍能看出在空間分布上明顯分開，分離程度較好，表明3組間的代謝模式存在差異。

2.3? 差異代謝物篩選

通過OPLS-DA對組間差異代謝物進行分析，結合單因素方差分析的結果，確定以下19種代謝物對模型組和正常組的分類貢獻較大，同時通過KEGG通路數據庫（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）明確與其相關的代謝途徑。利用這19種代謝物作為潛在的藥物靶標，發現參麥注射液組中9種代謝物水平向正常方向回調，其余10種代謝物水平無顯著變化，此外還發現異亮氨酸濃度上升。具體見表2。

3 討論

參麥注射液源自古方生脈散，主要成分為人參和麥冬的提取物，具有益氣復脈、養陰生津的功效，臨床上應用于心衰等眾多心血管疾病的治療[7]。現代研究發現，參麥注射液對心衰的作用機制與改善心肌舒縮功能和血流動力學、調控神經內分泌及細胞因子、改善心肌復極、改善心率變異性等有關，表現出多靶點的作用特點。代謝組學致力于考察生物體在不同狀態下內源性代謝產物種類、數量及變化規律，從而揭示代謝物與病理生理、藥物作用的關聯性。代謝組學技術的發展，為探索參麥注射液治療心衰的作用機制提供了新的工具和方法，有望發現新的治療靶點。

與正常組比較，模型組血漿中有19種代謝物水平出現明顯變化，可能為該模型的生物標志物。在此基礎上，利用這些差異代謝物作為潛在的藥物靶標進一步研究參麥注射液的作用機制。結果發現與模型組比較，參麥注射液組血漿中有9種代謝物水平向正常方向顯著回調和異亮氨酸濃度上升，提示參麥注射液對部分代謝紊亂的調節作用，可能是其治療心衰的作用機制之一。

現代研究表明，正常心臟主要依靠脂肪酸、葡萄糖和乳酸氧化供能，氨基酸的供能只占總能量的1%，心肌供能的變化可直接或間接導致心衰，這一過程被稱為“代謝重構”[8]。模型組出現顯著的氨基酸代謝紊亂，是因為心衰時機體的脂、糖代謝氧化供能障礙，需要動員氨基酸代謝以增強供能[9]。本研究發現參麥注射液對氨基酸代謝紊亂具有調節作用，主要體現在鳥氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺水平下調，以及亮氨酸、異亮氨酸水平上調。

亮氨酸、異亮氨酸屬于支鏈氨基酸（BCAAs），具有重要的供能作用。有研究[10]認為BCAAs在心肌應激時能加速分解以供給能量，促進心肌的蛋白質合成，減輕心肌的應激損傷;趙曉麗等[8]發現BCAAs對衰竭心臟具有保護作用，主要作用機制與促進衰竭心臟的蛋白質合成、加強心臟的糖異生、調節心肌能量代謝等相關，并認為給予機體適度補充BCAAs可以增加衰竭心臟的心肌能量供應、改善心功能。本研究發現參麥注射液組的亮氨酸、異亮氨酸水平上調，提示該藥物通過調節BCAAs起到保護衰竭心臟的作用。

丙酮酸是糖酵解途徑的產物，其水平異常提示模型組大鼠處于無氧糖酵解的應急代謝狀態，能量代謝效率降低[11]。丙氨酸可通過糖異生途徑轉化為葡萄糖，蘇糖醇為多元醇類代謝物，可通過不同途徑參與到糖類代謝中。上述代謝物的水平異常反映了模型組大鼠的糖代謝紊亂存在。參麥注射液組中丙氨酸、丙酮酸、蘇糖醇水平顯著回調，提示參麥注射液能有效調節糖代謝功能，機體的糖異生、糖酵解等代謝功能被過度激活的應急代謝狀態得到改善。

花生四烯酸是人體中分布最廣的多不飽和脂肪酸，具有酯化膽固醇、增加血管彈性等作用[12];膽固醇作為體內最豐富的類固醇化合物，是血脂的重要組成部分，花生四烯酸和膽固醇的水平上升提示模型組大鼠出現脂代謝紊亂，引起脂質堆積[13-14]。經參麥注射液干預后上述兩種代謝物的水平未出現顯著回調，提示該藥物治療心衰的作用機制可能與調節脂代謝無關。

本研究結果表明，與模型組相比，參麥注射液組的血漿代謝物水平更接近正常組。通過明確與差異代謝物相關的代謝途徑，揭示了參麥注射液對心衰的干預機制與改善糖代謝、氨基酸代謝紊亂，調節支鏈氨基酸，從而改善心臟能量代謝有關，未發現調節脂代謝紊亂的相關證據。

參考文獻

[1] 金雪娟，周京敏，葛均波.心力衰竭流行病學的研究進展[J].中國臨床醫學，2013，20（6）：852-855.

[2] OOSTEROM-CALO R， VAN BALLEGOOIJEN A J， TERWEE C B， et al. Determinants of adherence to heart failure medication： A systematic literature review[J]. Heart Fail Reviews， 2013，18（4）：409-427.

[3] KRUEGER K， BOTERMANN L， SCHORR S G， et al. Age-related medication adherence in patients with chronic heart failure： A systematic literature review[J]. International Journal of Cardiology，2015，18（4）：728-735.

[4] 陳可冀，吳宗貴，朱明軍，等.慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識[J].中國中西醫結合雜志，2016，36（2）：133-141.

[5] 李欣春，梁? 昊，胡志希，等.高血壓心衰大鼠證候本質及藥物干預研究[J].湖南中醫藥大學學報，2018，38（8）：853-857.

[6] 李欣春，梁? 昊，胡志希，等.高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：245-248.

[7] 李? 盼，王? 婷，付姝菲，等.基于Meta分析的參附、參麥注射液臨床作用比較[J].中草藥，2016，47（16）：2949-2959.

[8] 趙曉麗.慢性充血性心力衰竭患者血漿支鏈氨基酸水平的臨床研究[D].西安：第四軍醫大學，2014.

[9] 鐘森杰，李欣春，李? 杰，等.心氣陰兩虛證心力衰竭大鼠血漿代謝組學研究[J].湖南中醫藥大學學報，2018，38（9）：981-985.

[10] 梁國榮，曾瑞峰，溫丹婷，等.心衰心陽虛證血漿氨基酸（纈、苯丙、異亮、亮氨酸）代謝指紋圖譜研究[J].中華中醫藥雜志，2013，28（12）：3735-3738.

[11] 王? 歡，胡元會，孟? 浩，等.心復康口服液對心肌梗死后心力衰竭大鼠血漿代謝組學影響的研究[J].北京中醫藥，2013，32（8）：613-617.

[12] 韋藝丹，許美娟，季? 暉.花生四烯酸的ω-羥化代謝途徑與心腦血管疾病[J].中國臨床藥理學與治療學，2016，21（7）：826-833.

[13] 簡維雄，左和寧，劉? 韶，等.基于代謝組學的心血瘀阻證動態演變過程研究[J].中國中西醫結合雜志，2016，36（12）：1496-1503.

[14] 曾繁芳，王麗麗，龍? 娟，等.血漿總膽固醇水平與急性左心衰患者預后的相關性分析[J].中山大學學報（醫學科學版），2017，38（4）：556-560.