長期霧化吸入4種非霧化劑型藥物對健康SD大鼠肺組織的影響

唐榮國 赫倩 付磊 許昌業 王秀娟 李雄 歐維琳

摘 要 目的：研究長期霧化吸入4種非霧化劑型藥物對健康SD大鼠肺組織的損傷情況，評價其霧化吸入的安全性。方法：將40只健康SD大鼠（♂）按隨機數字表法分為8組，分別為空白對照組、生理鹽水組（溶劑對照）、布地奈德組（霧化劑型藥物對照，0.1 g/L）、二氧化硅組（肺損傷藥物對照，40 g/L）和4種非霧化劑型藥物組[定喘湯組（15 g/mL，以生藥量計）、頭孢曲松組（200 g/L）、清開靈組（原液）和痰熱清組（原液）]，每組5只。除空白對照組大鼠不作處理外，其余各組大鼠均霧化吸入給藥，給藥體積均為10 mL，每天給藥2次，連續給藥56 d。給藥結束后，對其外周血中白細胞進行分類、計數以及對支氣管肺泡灌洗液中白細胞進行計數；蘇木精-伊紅染色觀察其肺組織病理變化并進行塵細胞計數；免疫組化法檢測其肺組織中白細胞分化抗原163（CD163）表達水平。結果：各組大鼠外周血中白細胞分類主要有淋巴細胞和中性粒細胞，其中又以淋巴細胞為主。與空白對照組比較，生理鹽水組大鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數和肺泡灌洗液中白細胞計數以及肺組織中塵細胞計數差異均無統計學意義（P>0.05）；支氣管及肺組織結構完整，CD163表達為陰性。與生理鹽水組比較，布地奈德組大鼠上述指標差異均無統計學意義（P>0.05），支氣管及肺組織結構完整，CD163表達為陰性；而其余5組大鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數和支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數以及肺組織中塵細胞計數均顯著升高（P<0.05）；肺組織發生不同程度的肺泡壁增厚、肺泡間質水腫等病理變化，CD163表達均為陽性或強陽性。結論：4種非霧化劑型藥物長期霧化吸入后可引起健康SD大鼠肺組織不同程度的病理改變，炎癥細胞計數升高，肺泡中出現塵細胞。

關鍵詞 霧化吸入；非霧化劑型藥物；肺損傷；安全性；大鼠

Effects of Long-term Aerosol Inhalation of 4 Kinds of Non-aerosol Drugs to Lung Tissue of Healthy SD Rats

TANG Rongguo1，HE Qian1，FU Lei1，XU Changye1，WANG Xiujuan2，LI Xiong1，OU Weilin1（1.Dept. of Pediatrics， the Affiliated Hospital of Guilin Medical College， Guangxi Guilin 541001， China；2.Dept. of Clinical Laboratory， the Affiliated Hospital of Guilin Medical College， Guangxi Guilin 541001， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study lung tissue injury induced by long-term aerosol inhalation of 4 kinds of non-aerosol drugs in healthy SD rats， and to evaluate the safety of aerosol inhalation of non-aerosol drugs. METHODS： Totally 40 healthy SD rats （♂） were randomly divided into 8 group， i.e. blank control group， normal saline group （solvent control）， budesonide group （non-aerosol drug control， 0.1 g/L） ，silicon dioxide group （lung injury drug control， 40 g/L）and 4 kinds of non-aerosol drugs [Dingchuan decoction group （15 g/mL， calculated by crude drug）， cefatriaxone group （200 g/L）， Qingkailing group （stoste） and Tangreqing group （stoste）]， with 5 rats in each group. Except that blank control group didn’t received any treatment， other groups received aerosol inhalation， 10 mL， twice a day， for consecutive 56 days. After medication， the number of white blood cells in peripheral blood were counted and classified， and the number of white blood cells in bronchus alveolar lavage fluid were counted. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining and the number of dust cells was counted. The expression of leukocyte differentiation antigen 163 （CD163） in lung tissue were determined by immunohistochemical method. RESULTS： The white blood cells in peripheral blood mainly included lymphocyte and neutrophil， of which lymphocyte is the main one. Compared with blank control group， there was no statistical significance in the number of white blood cells， lymphocyte or neutrophil in peripheral blood， the number of white blood cells in alveolar lavage fluid or the number of dust cells in lung tissue of rats in normal saline group （P>0.05）； the structures of bronchus and lung tissue were intact， and the expression of CD163 was negative. Compared with normal saline group， there was no statistical significance in the above indexed of rats in budesonide group（P>0.05）， the structures of bronchus and lung tissue were intact， and the expression of CD163 was negative， while the number of white blood cells， lymphocyte or neutrophil in peripheral blood， the number of white blood cells in alveolar lavage fluid or the number of dust cells in lung tissue of rats in other 5 groups were all increased significantly （P<0.05）； alveolar wall thickening and alveolar interstitial edema occurred in different degrees in lung tissue. The expression of CD163 was positive or strongly positive. CONCLUSIONS： The long-term aerosol inhalation of 4 kinds of non-aerosol drugs can induce pathological changes of lung tissue and increase the number of inflammatory cell and dust cell in alveolin in healthy SD rats.

KEYWORDS Aerosol inhalation； Non-aerosol drugs； Lung injury； Safety； Rat

呼吸系統疾病是我國城鄉居民中最常見、病死率最高的疾病，而霧化吸入療法是呼吸系統相關疾病的重要治療手段，與口服、靜脈和肌肉給藥相比，霧化吸入療法因藥物直接作用于靶器官，具有起效迅速、療效佳、全身不良反應少、不需要患者刻意配合等優勢，被國內外廣泛應用[1]。霧化吸入療法常用的藥品有吸入型糖皮質激素和支氣管擴張劑，包括布地奈德、沙丁胺醇、特布他林、異丙托溴銨等[2]。但在我國臨床中，除了上述藥品外，將抗生素、中藥注射劑及中藥湯劑等用于霧化吸入治療呼吸道疾病也很常見，如張永進[3]、劉茜[4]、周曉楠[5]、陳秀芳[6]等分別報道了霧化吸入頭孢曲松（抗生素）、定喘湯（中藥湯劑）及痰熱清注射液、清開靈注射液（中藥注射劑）治療呼吸道疾病取得了較好的臨床療效，但均未進行安全性研究。

目前，對長期霧化吸入療法的安全性研究多以霧化劑型的糖皮質激素為代表藥物，安全性研究的指標多在生長發育、骨代謝以及腎上腺皮質功能等方面[7]。其他非霧化劑型藥物霧化吸入對肺組織的安全性研究多數是短期霧化，霧化時間多在5～7 d，安全性研究指標多在對呼吸系統黏膜的刺激性方面，而非霧化劑型藥物長期霧化吸入對肺損傷研究的報道則很少[8]。因非霧化劑型藥物含有部分不溶性微粒，類似細顆粒物2.5（PM2.5），通過霧化吸入到達肺部，可能對肺組織產生一定影響。所以筆者選用臨床上比較常用的霧化劑型藥物和幾種非霧化劑型藥物（類別包括抗生素、中藥湯劑、中藥注射劑）長期霧化吸入，觀察其對健康SD大鼠肺組織的影響，探討非霧化劑型藥物霧化吸入的安全性，為臨床合理使用霧化藥物提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

NE-C28壓縮式吸入器[歐姆龍自動化（中國）有限公司]；CX21顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DT5-6B醫用離心機（北京時代北利離心機有限公司）；PPTHK-21B攤片烘片烤片機（上海精密儀表有限公司）；2235輪轉式切片機（上海名元實業有限公司）。

1.2 藥品與試劑

清開靈注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號：160821，規格：10 mL）；布地奈德混懸液（商品名普米克令舒，澳大利亞阿斯利康公司，批號：LOT323881，規格：1 mg）；痰熱清注射液（上海凱寶藥業股份有限公司，批號：1701315，規格：10 mL）；二氧化硅（美國Sigma公司，批號：806765）；注射用頭孢曲松鈉（山東魯抗醫藥股份有限公司，批號：161104，規格：1.0 g）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，批號：161018707，規格：100 mL）；蘇子、黃芩、甘草、桑白皮等九味制備定喘湯的中藥材均購自桂林醫學院附屬醫院中藥房；兔單白細胞分化抗原163（CD163）[艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：ab182422）]；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發公司，批號：ZLI-9018）。

1.3 動物

健康SD大鼠40只，♂，清潔級，體質量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。各組實驗大鼠在桂林醫學院動物實驗中心飼養，保持室溫為22～26 ℃、相對濕度為40%～60%，自然光線照明，通風良好，任其自由飲水、攝食，墊料隔日更換1次。在實驗開始前3天進行適應性飼養。

2 方法

2.1 藥液的制備

（1）定喘湯。據《攝生眾妙方》[9]記載的定喘湯方劑組成：蘇子6 g、黃芩6 g、甘草3 g、桑白皮3 g、杏仁6 g、半夏9 g、麻黃9 g、款冬花9 g和白果9 g。按5倍方劑量稱取各藥材，加水1 000 mL，煮沸后文火煎至100 mL，過濾后藥液留用；藥渣重復加水1 000 mL再次如上煎煮。將2次藥液（共200 mL）混合后去藥渣，過濾濃縮，制成霧化吸入劑20 mL（每1 mL藥液中含生藥量為15 g），滅菌后置于4 ℃冰箱內保存，備用。每天霧化的中藥液當天煎煮配制。（2）布地奈德霧化溶液。將規格為1 mg/2 mL的布地奈德混懸液2 mL與0.9%氯化鈉注射液8 mL混合均勻，制備成質量濃度為0.1 g/L的霧化溶液，共10 mL。（3）頭孢曲松霧化溶液。將2 g注射用頭孢曲松鈉粉末溶于0.9%氯化鈉注射液中，制備成質量濃度為200 g/L的霧化溶液，共10 mL。（4）二氧化硅霧化溶液。取二氧化硅400 mg溶于0.9%氯化鈉注射液中，制備成質量濃度為40 g/L的霧化溶液，共10 mL。

2.2 分組與給藥

將40只大鼠按照隨機數字表法分為8組，即空白對照組（不作處理）、生理鹽水組（溶劑對照，0.9%氯化鈉注射液）、布地奈德組（霧化劑型藥物對照）、定喘湯組（非霧化劑型中藥湯劑）、頭孢曲松組（非霧化劑型抗菌藥物）、清開靈組（非霧化劑型中藥注射劑，原液）、痰熱清組（非霧化劑型中藥注射劑，原液）和二氧化硅組（肺損傷對照藥物），每組5只。參考文獻方法[10-11]并改良后進行霧化給藥：除空白對照組外，將其余各組大鼠放入自制的玻璃霧化缸中，缸相對密封，將霧管對準大鼠鼻面部并固定，向壓縮霧化器藥杯中分別加入相應藥液，給藥體積均為10 mL。從霧化開始到結束觀察大鼠的精神狀態、呼吸情況及活動情況。每天霧化給藥2次，持續給藥56 d[12-14]。

2.3 外周血中白細胞分類及計數

末次霧化給藥1 h后，摘眼球采血，將其中一管外周血樣本于室溫下靜置1 h后，1 000 r/min離心10 min，備用。在另一管外周血樣本中取20 μL全血，加入到0.38 mL 2%冰醋酸中稀釋，待紅細胞充分破壞后，充池改良牛鮑計數板中，靜置5 min后在低倍鏡下進行細胞計數，計數池內四角4個大方格內白細胞總數，根據白細胞數（L-1）=四個大方格內的白細胞總數÷4×10×20×106計算出最后結果，壓線細胞計數時數上不數下、數左不數右[15]。取1滴全血在載玻片上涂片，將血涂片用瑞特染液染色，沖洗干凈，自然干燥后待用。選擇血涂片體、尾交界處細胞分布均勻、著色良好的區域，滴加香柏油1滴，按一定的方向順序對所見的每個白細胞進行分類，并用白細胞計數器做好記錄，共計數100個白細胞。按分類后細胞所占比例計算出各細胞總數。

2.4 支氣管肺泡灌洗液中的白細胞計數

采血后過量麻醉處死大鼠，打開胸腔后留取左肺組織，剝離右肺。用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗右肺3次，每次3 mL，使支氣管肺泡灌洗液（BALF）的回收率>80%，然后以1 000 r/min離心10 min，棄上清得到沉淀細胞。用50 μL的PBS重懸細胞沉淀，取出10 μL的重懸液加入90 μL Tris-氯化銨紅細胞裂解液（Tris-NHCl4）裂解紅細胞1～2 min后，取裂解后溶液10 μL進行白細胞計數。

2.5 肺組織病理學觀察及塵細胞計數

取大鼠左肺組織，置于10%中性福爾馬林中固定24 h，常規梯度乙醇（100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇）脫水，自來水沖洗；蘇木精染色5～10 min，自來水沖洗；在0.5%鹽酸-乙醇溶液中分化1～2 s，溫水浸泡沖洗；置于伊紅染液中染色30 s，自來水沖洗；分別在95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇中依次脫水，透明，切片烘干，封片，置于顯微鏡下觀察肺組織病理學變化，從每組中取1張片，通過觀察10個不同高倍（×400）視野下的塵細胞并對其進行計數，最后求平均值。

2.6 肺組織中CD163表達檢測

采用免疫組化法。常規制備組織玻片后，脫蠟至水，3%H2O2溶液孵育后高壓熱修復，加入山羊血清孵育，加CD163抗體（1 ∶ 500），4 ℃孵育過夜，按照試劑盒說明書進行二抗孵育及DAB顯色，常規蘇木精復染、鹽酸乙醇分化液分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，在高倍（×400）視野下觀察CD163陽性表達細胞百分比，每張切片隨機選取5個不重疊視野。以肺組織切片中細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性表達，根據陽性細胞百分比評分和細胞的染色強弱評分的總得分來綜合判定陽性表達情況。陽性細胞的百分比評分標準：<1%，計0分；1%～10%，計1分；11%～30%，計2分；31%～60%，計3分；>60%，計4分。細胞的染色強弱評分標準：基本不著色，計0分；淡黃色，計1分；黃色或棕褐色，計2分；深棕色，計3分。陽性表達情況：總得分0～1分，陰性（-）；總得分2～3分，弱陽性（1+）；總得分4～5分，陽性（2+）；總得分6～7分，強陽性（3+）[16]。所有肺組織病理改變觀察均由本課題組內兩位成員分別負責閱片，其中一位為病理科主任醫師。

2.7 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。對所有計量資料行正態分布檢驗，若符合正態分布，數據以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法進行組間兩兩比較，不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠行為學觀察結果

實驗階段8組大鼠均無死亡情況。每次給藥后，除空白對照組、生理鹽水組、布地奈德組外，其余各組大鼠均出現不同程度的面部搔癢、抓鼻、毛發豎直等表現，且隨著霧化時間的延長大鼠相應癥狀愈加明顯，但呼吸無明顯改變。

3.2 外周血及BALF中細胞分類、計數結果

各組大鼠外周血中白細胞主要有淋巴細胞和中性粒細胞，其中以淋巴細胞為主。與空白對照組比較，生理鹽水組大鼠外周血中白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞計數以及BALF中白細胞計數差異均無統計學意義（P>0.05）；與生理鹽水組比較，布地奈德組大鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數以及BALF中白細胞計數差異均無統計學意義（P>0.05），而其余各組大鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數以及BALF中白細胞計數均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠外周血中白細胞分類計數及BALF中白細胞計數結果見表1。

3.3 肺組織HE染色病理學改變觀察及塵細胞計數結果

3.3.1 HE染色觀察結果 空白對照組、生理鹽水組和布地奈德組大鼠支氣管及肺組織結構均完整；其他各組大鼠肺組織均有不同程度的肺泡壁增厚，肺泡間質水腫，肺泡腔及肺間質可見數量不等的塵細胞，淋巴細胞增多。其中以二氧化硅組大鼠病變最明顯，定喘湯組次之。此外，清開靈組大鼠肺間質厚度不一，肺泡腔少量充血，可見塵細胞及大量淋巴細胞聚集；痰熱清組大鼠肺間質充血，肺泡間質可見少量水腫液，支氣管管壁纖毛排列不整齊，出現斷裂，淋巴細胞明顯增多、散在分布。各組大鼠肺組織切片HE染色觀察結果見圖1。

3.3.2 塵細胞計數結果 與空白對照組比較，生理鹽水組大鼠肺組織中塵細胞計數差異均無統計學意義（P>0.05）；與生理鹽水組比較，布地奈德組大鼠肺組織中塵細胞計數差異無統計學意義（P>0.05），而其余5組大鼠肺組織中塵細胞計數均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肺組織中塵細胞計數結果見表2。

3.4 肺組織中CD163表達結果

空白對照組、生理鹽水組及布地奈德組大鼠肺組織中未見CD163表達，生理鹽水組與空白對照組以及布地奈德組與生理鹽水組間比較總評分差異均無統計學意義（P>0.05）； 清開靈組、頭孢曲松組、痰熱清組大鼠肺組織中CD163均呈陽性表達，二氧化硅組及定喘湯組大鼠肺組織中CD163均呈強陽性表達，以上5組的總評分較生理鹽水組均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肺組織中免疫組化圖見圖2，CD163表達測定結果見表3。

4 討論

霧化吸入給藥通過呼吸能直接作用于患部，使到達患部的藥物分布均勻，可增加病灶的藥物濃度，減少體內藥物代謝對人體的影響，縮短起效時間，是一種經濟、簡便的給藥方式[17]。因霧化吸入糖皮質激素具有療效可靠、安全性良好和易操作等特點，不僅可用于支氣管哮喘的長期控制和急性發作，也可用于急性喉氣管支氣管炎、肺炎支原體感染等其他呼吸系統疾病的治療[18]。本研究結果顯示，空白對照組、生理鹽水組、布地奈德組大鼠支氣管及肺組織結構完整，肺組織病理切片免疫組化染色未見CD163表達，布地奈德組大鼠外周血及BALF中白細胞計數與生理鹽水組比較差異無統計學意義，提示吸入型糖皮質激素類藥物布地奈德對SD大鼠肺組織是安全的。

美國FDA于1997年批準了妥布霉素吸入劑上市，但只用于治療囊性纖維變性患者因銅綠假單胞菌引起的肺部感染，可降低細菌計數、減少痰液量、改善肺通氣功能[19]。臨床上用于霧化吸入的抗菌藥物有β-內酰胺類的頭孢曲松、氨基糖苷類、抗真菌藥物等[20]。我國《霧化吸入療法在呼吸疾病中的應用專家共識》[1]指出，由于目前我國尚無專供霧化吸入的抗菌藥物制劑，不推薦以靜脈藥物替代霧化制劑使用。但在我國臨床實際中，關于應用抗生素霧化吸入治療呼吸道感染性疾病的文獻很多，均報道取得良好的療效，而關于霧化吸入抗生素的安全性研究則未見報道。本研究結果顯示，頭孢曲松組大鼠肺組織HE染色后可見肺泡壁增厚，肺泡間質水腫，肺泡腔及肺間質可見數量不等的塵細胞，淋巴細胞增多。該結果提示，將抗菌藥物頭孢曲松霧化吸入給藥，會造成大鼠肺組織病變。

20世紀80年代以來，國內用中藥霧化吸入進行臨床診療及臨床研究較為廣泛，大多認為中藥霧化吸入治療呼吸系統疾病效果確定[21]。有研究顯示，注射劑除了藥物成分還含有各種表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑及藥物溶解劑等輔料，這些輔料靜脈注射有可能會導致過敏、溶血等不良反應，還可能誘發哮喘發作[22]。也有報道指出，注射劑在生產和使用過程中可產生或混入粒徑1～50 μm的微粒雜質，這些不溶性微粒進入血管有可能引發血栓、肉芽腫、炎癥反應等[23]。本研究結果顯示，霧化吸入中藥注射劑消開靈和痰熱清后大鼠肺間質厚度不一，肺泡腔少量充血，可見塵細胞及大量淋巴細胞聚集，這提示靜脈用中藥注射劑用于霧化給藥會使肺組織產生一定的病變。這些肺組織的病變，是藥品本身的化學成分還是藥品的添加劑，亦或者是藥品的pH值、滲透壓等理化性狀造成的，還需要進一步研究。

與中藥注射劑相比，中藥湯劑的組成更為復雜，少則幾味多則數十味藥材，有形成分多并且許多成分不明，煎成的湯劑中肉眼即可見到大量的不溶性顆粒。Ghio AJ等[24]研究發現，給予38名正常健康志愿者吸入大氣污染顆粒物后，BALF中炎性細胞計數明顯增多。在本研究中，定喘湯中含有微粒數最多，還有肉眼可見的微粒。HE染色結果也顯示，定喘湯組大鼠肺組織病理改變最明顯，塵細胞計數最多。可見，中藥湯劑用于霧化會對肺組織產生一定的損害。

CD163是一種特異清道夫受體，主要存在于不同器官和組織的巨噬細胞上，尤其是肺巨噬細胞，但僅表達于活化的巨噬細胞與單核細胞表面。在感染性炎癥中主要介導細胞內吞作用，其陽性表達提示巨噬細胞活化及肺損傷的存在[25]。肺泡巨噬細胞是呼吸系統對抗外來顆粒的第一道防線，吸入空氣中的塵粒、細菌等多被巨噬細胞清除，胞質中含有大量塵粒的肺泡巨噬細胞，又稱塵細胞[26]。部分塵細胞可隨痰液咳出，還有部分塵細胞在吞噬顆粒的毒性作用下崩解，顆粒沉積在間質中，刺激成纖維細胞增生，進一步可形成間質纖維化改變[27]。二氧化硅組大鼠吸入塵粒，形成塵細胞后會對大鼠肺組織存在影響。在本研究中，生理鹽水組、布地奈德組大鼠的肺組織結構基本正常，肺組織中CD163呈陰性表達。同時，清開靈組、頭孢曲松組、痰熱清組大鼠肺組織中CD163均呈陽性表達，二氧化硅組及定喘湯組CD163均呈強陽性表達。因此，筆者推測，CD163的高表達及塵細胞計數增加可能與肺組織損傷存在一定的相關性。

本研究只針對SD大鼠吸入不同的藥物品種所導致的肺組織損傷進行了研究觀察，但并未設計和觀察霧化吸入同一品種藥物不同濃度、不同時間節點的肺組織病理改變，也未對產生肺組織損害的機制進行更為深入的研究，存在著一定的局限性。但是，本研究結果證明了使用非霧化劑型藥物進行霧化治療存在著安全隱患，長期霧化吸入會導致肺組織損傷。故筆者認為，在臨床實踐中，還是應當按照藥品說明書規定的給藥途徑進行規范化治療，不宜將非霧化劑型的藥物用于霧化吸入治療。

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（收稿日期：2018-12-06 修回日期：2019-03-27）

（編輯：林 靜）