羊毛角蛋白的溶解機制研究

薩如拉　春花　劉鑫巖　譚穎慧　尹利國　宮川剛　棚橋光彥

摘要：以羊毛為原料，采用熔融尿素法溶解羊毛分析其溶解機制.分別使用谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等標準化合物替代羊毛角蛋白中主要的氨基酸、肽鍵及化學鍵，與150℃熔融尿素反應20min，經乙酸乙酯分液3次，有機層脫水濃縮，丙酮溶解，GC-MS分析，檢測其反應產物及化學鍵的變化.結果表明：在使用不同標準化合物與熔融尿素反應中發現，僅胱氨酸、亮氨酸和甘氨酰-L-亮氨酸與尿素發生化學反應，部分二硫鍵及肽鍵發生斷裂，其余標準化合物與尿素未發生化學反應.綜上可知，在溶解條件為150℃ 20min時，尿素僅切斷羊毛角蛋白中少量二硫鍵或肽鍵，使得羊毛角蛋白仍保持較高的分子量.

關鍵詞：熔融尿素法;羊毛;溶解機制;角蛋白

中圖分類號：TS102.311? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）09-0030-03

羊毛作為一種天然蛋白質資源，在國際上被認為是一種具有潛在價值的蛋白質，其蛋白含量高達99%[1].羊毛產業的廢棄物、舊衣料品等每年大量產生[2]，僅其中一部分被重復利用，大部分廢棄物被焚燒處理或填埋處理，這不僅污染了環境，更主要的是浪費了大量的蛋白質資源[3].因此，為了減輕環境負擔，發展可持續性開發利用，研究羊毛角蛋白的提取方法和應用價值是目前亟待解決的問題.羊毛角蛋白的提取溶解是其再利用的至關重要的步驟，它對羊毛角蛋白的性能及其應用具有顯著的影響[4].然而，大分子羊毛角蛋白內的二硫鍵使肽鏈內部和肽鏈之間發生交聯，形成立體網狀結構，使之難以溶解[5]，這給羊毛角蛋白的提取造成極大地困難.目前羊毛角蛋白的提取方法主要有酸堿法[6]、還原法[7]、酶法[8]、離子液體法[9]等，這些方法不僅需要大量的化學試劑造成環境污染，而且成本高、周期長、效率低.因此，開發新型的羊毛角蛋白提取技術是行之有效的方法之一，為實現高效、經濟、環保的目標奠定基礎[10].

棚橋光彥等開發了新型的羊毛角蛋白的提取方法-熔融尿素溶解法[11].本方法只使用尿素和乙醇，而尿素的熔融溫度低，安全可靠，成本低，適合于大量生產，且尿素與乙醇可以回收循環利用.另外需要的時間短，尿素和羊毛角蛋白的分離過程簡便，分離的蛋白質可以直接當作有機肥料或飼料等產品.經過實驗已經確認羊毛在熔融尿素中可完全溶解，但具體的溶解機制尚不明確.因此，本文使用標準化合物替代角蛋白中的主要氨基酸、肽鍵及化學鍵與熔融尿素進行化學反應，使用GC-MS分析反應產物及二硫鍵及肽鍵的斷裂狀況，旨在探究熔融尿素法提取羊毛角蛋白的溶解機制.

1 實驗材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器設備

材料：羊毛日本毛絨株式會社.

試劑：尿素、乙酸乙酯、氯化鈉、硫酸鈉、丙酮，化學試劑均為分析純.

標準化合物：谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸和甘氨酰甘氨酰甘氨酸.

儀器設備：高溫油浴鍋、日本島津氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）-QP5050A.

1.2 實驗方法

1.2.1 標準化合物的選擇

為了分析熔融尿素溶解羊毛的反應機理，分別選用谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等標準化合物來替代羊毛角蛋白中的主要氨基酸、肽鍵及化學鍵與尿素進行化學反應.

1.2.2 尿素與標準化合物的化學反應

于干燥試管中加入2g尿素，在150℃油浴鍋中加熱至尿素熔融，再加入0.2g標準化合物，150℃反應20min，取出試管加入8mL的蒸餾水，冷卻至室溫，加入乙酸乙酯10mL，進行3次分液.有機層由20mL的食鹽水脫水一次，再使用硫酸鈉脫水，過濾除去硫酸鈉，濃縮，加入丙酮（c=g/L）溶解，進行GC-MS分析.

GC-MS分析條件如下：進樣溫度230℃，氣化室溫度300℃，初始溫度為100℃，保持5min，以10℃/min速率上升至300℃，保持5min，分析時間為30min[12].

測定儀器為GCMS-QP5050A;電離模式：EI（電子電離）;電壓：70eV;毛細管柱：DB-5MS（J&W Scientific）、0.25mm（I.D.）×30m（L）×0.5μm;載氣：He;測定方法：掃描.

2 結果與分析

2.1 尿素與胱氨酸反應

尿素與胱氨酸反應產物的有機層GC-MS色譜分析結果及峰對應化合物的結構如圖1.胱氨酸與尿素反應后保留時間11min到15min之間出現了3種與環化尿素結合的胱氨酸化合物.3種化合物的區別在于是否含有二硫鍵，11min時出現的化合物的二硫鍵已經斷裂，15min時出現的化合物仍然含有二硫鍵.本實驗中尿素與胱氨酸反應產物的有機層回收量比較少，不能確定上述產生3中化合物的反應途徑為主要的反應途徑，但可以得到尿素切斷二硫鍵的結果.

2.2 尿素與亮氨酸反應

尿素與亮氨酸反應產物的有機層GC-MS色譜分析結果及峰對應化合物的結構如圖2.亮氨酸與尿素的反應也與胱氨酸反應一樣，在保留時間15min的時候出現與環化尿素結合的亮氨酸化合物的峰.

2.3 尿素與甘氨酰-L-亮氨酸反應

甘氨酰-L-亮氨酸與尿素反應產物的有機層GC-MS色譜分析結果及峰對應化合物的結構如圖3.在保留時間15min時候出現了與環化尿素結合的亮氨酸化合物峰，本實驗也與胱氨酸反應同樣，甘氨酰-L-亮氨酸與尿素反應產物有機層的回收量比較少，有可能尿素與甘氨酰-L-亮氨酸反應積極性不是很大，但與環化尿素結合的不是二肽而是氨基酸，可以得出尿素切斷肽鍵的結果.

2.4 尿素與其他氨基酸及肽的反應

尿素與谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸的反應產物的有機層中未發現尿素的反應產物.尿素與谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸有可能不產生化學反應，不切斷甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸的肽鍵.

3 結論與討論

本文研究了羊毛在熔融尿素中的溶解機制.在使用標準化合物與熔融尿素的反應中，僅亮氨酸、胱氨酸、甘氨酰-L-亮氨酸與尿素發生化學反應，部分二硫鍵及肽鍵發生斷裂，其余標準化合物谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸與尿素未發生化學反應.可知，在溶解條件為150℃ 20min時，尿素僅切斷羊毛角蛋白中少量二硫鍵或肽鍵，使得羊毛角蛋白仍保持較高的分子量.這與Murate[14]等的十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測定溶解羊毛角蛋白分子量的實驗結果一致.為了更詳細了解羊毛在熔融尿素中的溶解機制，分析20種氨基酸與尿素的反應是下一步需要研究的課題.

隨著纖維產業的廢棄物、破舊的衣料等蛋白纖維日益增加，如何利用廢物纖維蛋白質已成為一個重要的課題，熔融尿素法可以從廢棄的蛋白質纖維中大量提取蛋白質，為纖維蛋白的有效利用（比如加工成蛋白質飼料或有機氮肥料等產品）提供了參考.

——————————

參考文獻：

〔1〕Wang J B， Liu J Y， Wang J， et al. The Efficient Wool Keratin Dssolution Based on New Reductant [J].Advanced Materials Research， 2012， 441： 656-660.

〔2〕房啟海，朱平，董朝紅等.熔融尿素法提取羊毛角蛋白工藝研究[J].青島大學學報，2016，31（2）：71-75.

〔3〕Zhao W， Yang R J， Zhang Y Q， et al. Sustainable and Practical Utilization of Feather Keratin by an Innovative Physicochemical Pretreatment： High Density Steam Flash-Explosion[J].Green Chemistry ，2012，14（12）：3352-3360.

〔4〕賈濟如，姚金波.廢棄羊毛角蛋白循環利用研究的最新進展[J].毛紡科技，2015，43（1）：45-49.

〔5〕李鵬飛，洪穎，陳雙春，等.角蛋白的提取及其生物醫學應用[J].高分子通報，2013（6）：7-11.

〔6〕Toran-Diaz I， Jain V K， Allais J J， et al. Effect of Acid or Enzymatic Hydrolysis on Ethanol Production by Zymomonas Mobilis Growing on Jerusalem Artichoke Juice [J]. Biotechnology Letters， 1985，7（7）：527-530.

〔7〕徐恒星，史吉華，周奧佳，等.羊毛角蛋白的提取及其成膜性[J].紡織學報，2010，33（6）：41-47.

〔8〕Eslahi N， Dadashian F， Nejad N H. Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Wool Fiber for Nanoparticles Production Using Response Surface Methodology [J]. Advanced Powder Technology， 2013， 24（24）：416-426.

〔9〕Li R， Wang D. Preparation of Regenerated Wool Keratin Films from Wool Keratin-Ionic Liquid Solution [J]. Journal of Applied Polymer Science， 2013， 127（4）：2648-2653.

〔10〕王麗靜，史吉華，周奧佳，等.新型羊毛角蛋白提取技術探究[J].毛紡科技，2013，41（5）：1-6.

〔11〕Tanahashi M， Murate H. Method of Classifying Proteins， Method of Dissolving Proteins， Method of Fractionating and Collecting Nonanimal Fiber and Proteins Originating in Animal Fiber： WOPatent，119596 A1[P]，2009.

〔12〕薩如拉，陳建興，春花等.高壓水蒸氣蒸餾法提取和厚樸樹枝有效精油成分[J].河南農業科學，2017，46（5）：152-156.

〔13〕山內清.ケラチンの化學と利用-現在の課題[J].高分子，2001，50（4）：241-243.

〔14〕Murate H， Shigematsu M， Abe K， et al. Molten urea as a novel dissolving solvent for wool and other animal proteins[J].Fiber，2010，66（6）：156-159.