松花菜小孢子發育的細胞學觀察

朱惠霞 陶興林 劉明霞

摘要：以松花菜F1代雜交種為材料，分別觀察自然發育和游離培養條件下小孢子的發育過程。結果表明，自然條件下，四分體釋放小孢子后，單核小孢子經歷2次分裂，從雙核期到三核期，最后發育為成熟花粉粒，是配子體發育途徑;在游離培養條件下，小孢子經過熱激（33 ℃）處理后，發生均等分裂或者不均等分裂，之后經過一系列的細胞增殖，最終發育成為胚狀體，小孢子發育途徑是從配子體向胚胎發育轉換的途徑。同時發現，并不是所有發生了分裂和增殖的細胞都能形成胚狀體，只有極少數小孢子最終形成正常胚。

關鍵詞：松花菜;小孢子;細胞學觀察

中圖分類號：S653.3? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2019）08-0008-04

Abstract：Used the loose-curd cauliflower F1 hybrids as study material， microspore development process of in vivo was observed under natural development and free culture conditions， respectively. The results showed that under natural conditions， after the tetrad releases microspore， the mononuclear microspore undergoes two divisions， from binuclear to trinuclear stage， and finally develops into mature pollen grains， which is the way of gametophyte development. Under the condition of free culture， microspore undergoes equal or unequal division after heat shock treatment（33 ℃）. After a series of cell proliferation， microspore eventually develops into embryoid. The microspore development pathway is from gametophyte to embryo. At the same time， it was found that not all cells that divide and proliferate can form embryoids， only a few microspores eventually form normal embryos.

Key words：Loose-curd cauliflower;Microspore;Cytological observation

松花菜是十字花科甘藍屬花椰菜的一個類型，其外形特點為花層薄蕾枝長，花球膨大時呈松散狀，松花菜外形美觀、營養豐富，葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性糖含量均高于普通花椰菜[1 ]。食用時口感甜脆，風味鮮美、深受消費者喜愛。目前我國松花菜種植面積已達10萬hm2以上[2 ]， 正逐步替代傳統緊實型花椰菜，成為新的消費類型。目前游離小孢子培養技術已普遍應用于松花菜新品種的選育過程[3 - 5 ]，該技術純合速度快，可以大大縮短育種年限、豐富育種資源，是一種快速、高效的育種途徑。但游離小孢子培養技術除受材料基因型影響外，還易受培養過程中不確定因素的影響[6 - 7 ]。我們對松花菜小孢子培養技術和胚胎發生過程進行研究，對游離培養過程中小孢子的發育情況進行細胞學觀察，以明確小孢子發育時期與細胞形狀及花蕾長度的關系，為進一步提高松花菜小孢子培養效率提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

供試材料為甘肅省農業科學院蔬菜研究所花椰菜課題組引進的松花菜F1代雜交種雪美65。于2017年8月25日育苗， 9月30日定植于皋蘭日光溫室，常規管理。12月下旬植株抽薹開花，選取健壯植株上的花蕾，進行細胞學觀察和游離小孢子培養。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 小孢子發育過程觀察? ? ?利用DAPI（4，6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽）熒光染色法觀察小孢子發育時期。DAPI染色液的配制參照孫繼峰等[8 ]的方法，稱取5 mg的DAPI，加入5 mL ddH2O溶解，配成1 mg/mL的母液，用離心管分裝后置于-24 ℃冰箱保存。將完全溶化后的染色液用ddH2O稀釋成10 μg/μL的工作液，選取不同大小的花蕾，用鑷子小心摘取2～3枚花藥，置于滴有DAPI染液的載破片上，輕輕擠壓出花粉，挑出雜質，蓋上蓋玻片，在避光條件下染色10 min，用Olympus CKX53熒光倒置顯微鏡進行細胞學觀察，隨機觀察5個視野。觀察游離培養小孢子發育時期時，取1個培養皿小孢子培養液在1 000 r/min條件下離心5 min，取1滴沉淀于載玻片上，加1滴DAPI染色10 min后進行觀察，也可直接將培養皿置于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2? ? 小孢子分離與培養? ? 選取單核靠邊期的花蕾，用75%的乙醇消毒30 s，之后用7%的次氯酸鈉溶液消毒10～12 min，再用無菌水沖洗3次，每次3～5 min。將花蕾放入無菌小燒杯中，加入適量B5液體培養基，用玻璃棒輕輕擠壓，使小孢子游離到溶液中，用350目孔徑尼龍篩網過濾，濾液在1 000 r/min條件下離心3次，每次5 min。最后1次離心后將沉淀懸浮于NLN-13（pH=5.9）培養基中，調整小孢子密度為10×104個/mL，分裝到60 mm無菌培養皿中，每皿加4 mL懸浮液（每皿約為4個花蕾），并加入100 uL的活性炭（1.0 g/L）。在33 ℃熱激培養 24～48 h后轉入25 ℃恒溫箱暗培養，培養期間每天觀察小孢子發育情況，當肉眼可見胚狀體時轉入搖床（60 r/min）震蕩培養，約20 d后形成子葉型胚。

2? ?結果與分析

2.1? ?松花菜小孢子體內發育過程

觀察發現，發育初期花粉母細胞經減數分裂形成四分體（圖1-A）;然后小孢子從四分體中釋放出來，形成體積較小的單核小孢子，此時花粉壁較薄，細胞核位于中央，外形呈梅花形（圖1-B）。此后，小孢子逐漸生長，細胞壁開始加厚，內部形成大液泡，細胞核靠近邊緣，為單核靠邊期;外形為不明顯的三棱狀（圖1-C），此時是進行松花菜小孢子培養的適宜時期。隨著花蕾的發育，小孢子形狀接近正圓，進入雙核早期，具有1大1小2個細胞核。此后生殖核分裂成2個精核，小孢子進入三核期（圖1-D），較大的為營養核，染色質松散，DAPI染色后亮度較弱;較小的2個為生殖核，染色后亮度較高，體積由圓形變為橢圓，形成熟花粉粒。在整個發育過程中，小孢子的大小、形態以及染色深淺明顯不同，這為準確判斷小孢子發育時期和精確取樣提供了依據。

2.2? ?小孢子發育時期與花蕾大小的關系

細胞學觀察發現，松花菜小孢子發育時期與花蕾長度大小的關系基本為：四分體時期1.00～1.80 mm;單核中期1.81～2.59 mm;單核靠邊期2.60～3.60 mm;雙核期3.61～4.20 mm;成熟期4.21 mm以上。在松花菜小孢子培養中，處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子才具備胚狀體發生能力。在本研究條件下，處于2.90～3.80 mm的花蕾中單核靠邊期小孢子所占比例較大，在此范圍內精確取樣更易獲得較高的出胚率。但不同品種花蕾略有差異，因此花蕾長度不能作為取樣的唯一標準。

2.3? ?游離培養小孢子發育的細胞學觀察

經顯微觀察發現，培養之前的新鮮小孢子發育整齊一致，大小相同，形狀為不明顯三棱狀或基本接近圓形（圖2-A）。培養皿置于33 ℃黑暗條件下熱激培養1～2 d后，部分小孢子體積膨大，部分小孢子對熱擊反應不敏感，未發生膨大（圖2-B）。膨大細胞在培養2～3 d內發生第1次分裂，分裂方式一般為對稱分裂和不對稱分裂，發生對稱分裂時形成2個體積大小相同的細胞（圖2-C）;發生不對稱分裂時形成2個體積不同的細胞（圖2-D）。之后經過多次分裂和細胞增殖（圖2-E）。培養28 d左右時出現肉眼可見白色胚狀體，大多為心形胚（圖2-F）。將培養皿轉移到搖床上（60 r/min）培養3～5 d之后，發育成子葉形胚（圖2-G）。將培養的子葉胚轉接在B5固體培養基上12～21 d后，部分胚可直接分化成苗，部分形成愈傷組織進行再分化，分化好的小苗轉入MS固體培養基中，繼續培養7～14 d即長成幼苗。

2.4? ?游離小孢子培養過程的細胞學觀察

觀察發現，在培養過程中，游離小孢子經過一系列的分裂和增殖過程，最終形成小孢子胚。但不是所有小孢子都能形成胚胎，部分小孢子在熱擊后并不發生膨大，有一些只發生體積膨大而細胞核不進行增殖（圖3-A）;有一些發生分裂和增殖，在培養過程中會形成3細胞和4細胞以及多細胞團（圖3-B、C、D），但培養多日也未發育成胚狀體，細胞壁不發生破裂。觀察還發現，小孢子胚在培養過程的任何時候都可能停止發育，只有極少數膨大細胞最終形成胚狀體。

3? ?小結與討論

本研究通過DAPI熒光染色和普通光學顯微觀察比較了自然條件和游離培養條件下小孢子的發育過程。結果表明，自然條件下，正常花粉小孢子發育是配子體發育途徑，單核小孢子進行2次減數分裂，最終形成具有3個核的成熟花粉粒。游離培養小孢子胚胎發生的途徑是：小孢子在熱擊處理后膨大，之后發生均等分裂或不均等分裂產生2細胞，再經一系列分裂增殖過程形成胚狀體。在胚胎發生過程觀察中發現，有一些小孢子只發生體積膨大，細胞核不進行增殖;有一些發生增殖，在培養過程中能夠形成3細胞和4細胞以及多細胞團，但細胞壁不發生破裂，最終只有極少數膨大細胞最終形成正常胚狀體，這大大影響了松花菜小孢子培養的成功率。即使發生了膨大和增殖的小孢子，在培養過程的任何時候都有可能停止發育，導致這些小孢子胚胎停止發育的原因目前還不明確，因此，松花菜小孢子培養過程中造成細胞的停止發育的原因，以及繼續改善培養條件，促進小孢子胚胎的發生，提高成胚率，是今后研究的重點。

參考文獻：

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[6] 朱惠霞，陶興林，胡立敏，等.? 青花菜綠雄60小孢子單核靠邊期與花蕾外部形態特征研究[J].? 甘肅農業科技，2017（6）：19-21.

[7] 朱惠霞，陶興林，劉明霞.? 10個松花菜品種在蘭州地區的引種試驗初報[J].? 甘肅農業科技，2018（12）：16-19.

[8] 孫繼峰.? 溫度對青花菜小孢子胚胎發生的影響及機理研究[D].? 北京：中國農業科學院，2014.

（本文責編：楊? ? 杰）