ATRA聯合L-OHP對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用

趙品勇 孟祥林 周燕萍

【摘 要】目的：研究全反式維甲酸（ATRA）聯合奧沙利鉑（L-OHP）對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用。方法：將人肝癌細胞株SMMC-7721用含有胎牛血清的培養液培養后，用MTT法對不同樣品試劑對細胞的抑制作用進行檢測。結果：培養48 h后ATRA組與L-OHP組一部分細胞凋亡;聯合各組細胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細胞無顯著增加。48 h時各組藥物對SMMC-7721細胞的抑制作用最明顯;ATRA聯合L-OHP各組的作用最顯著，與其他組相比，P<0.05;各聯合組之間無顯著差異。結論：ATRA聯合L-OHP可加強對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用。

【關鍵字】ATRA;L-OHP;人肝癌細胞SMMC-7721;抑制作用

【Abstract】Objective： To study the inhibition effect of Tretinoin（ATRA） combined with third Oxalipatin（L-OHP） on human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721. Methods： Human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was cultured in a medium containing fetal bovine serum， and the inhibitory effects of different sample agents on the cells were detected by MTT method. Results： After 48 hours of incubation， some cells in ATRA group and L-OHP group were broken and apoptotic， while the number of cells in combination group decreased significantly; but there was no significant increase in apoptotic cells in each group after 72 hours of incubation. At 48 hours， the inhibition of each group on SMMC-7721 cells was the most obvious. Compared with other groups， the effect of ATRA combined with L-OHP was the most significant， P < 0.05; but there was no significant difference among the combined groups. Conclusion： ATRA combined with the third generation platinum anticancer compounds can enhance the inhibition of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells.

【Key words】 ATRA; L-OHP; Human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721; Inhibition

肝癌，包括原發性肝癌和轉移性肝癌兩種，人們常說的肝癌多指原發性肝癌，而原發性肝癌85%-90%為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是我國最常見的惡性腫瘤之一。當機體組織細胞不受體內調節機制的控制，發生多次遺傳突變和積累，則產生癌變，而從細胞凋亡的角度來看，腫瘤的發生是由于凋亡受阻所致。因此，選擇性誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療惡性腫瘤的重要手段之一。有研究文獻資料表明[1]，全反式維甲酸（Tretinoin， ATRA）可誘導腫瘤細胞分化和凋亡。奧沙利鉑（Oxalipatin， L-OHP） 屬第3代鉑類抗腫瘤化合物，可抑制DNA的合成，產生細胞毒作用及誘導細胞凋亡的作用[2]。本研究通過比較不同樣品試劑對肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用，探討ATRA聯合L-OHP能否加強對人肝癌細胞的抑制作用，為藥物聯合使用治療肝細胞癌提供線索和參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 人肝癌細胞株SMMC-7721購自中科院上海藥物研究所;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM高糖培養基均購自美國Hyclone公司;ATRA、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲

基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司， 其中，ATRA用無水乙醇配制成濃度為10-2mol/L、MTT用PBS液配制成濃度5 g/L、DMSO除菌后，于-20 ℃冰箱中存儲;注射用奧沙利鉑（0.1/支），齊魯制藥（海南）有限公司，生產批號：EA2E7001A。

1.1.2 實驗儀器 BKQ-B50II立式高壓蒸汽滅菌器，博科控股集團有限公司;SW-CJ-1BU單人單面凈化工作臺，浙江孚夏醫療科技有限公司;37XB倒置顯微鏡，上海永享光學儀器制造有限公司;移液器，上海榮泰生化工程有限公司;GZX-GF-MBS-1電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械廠;TGL-18M高速臺式冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司;優普UPR-II-5TNZ純水機，四川優普超純科技有限公司;BDF-86V158立式實驗室冰箱，博科控股集團有限公司;SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞復蘇、培養 常規消毒超凈臺，取出裝有人肝癌細胞株SMMC-7721的凍存管，迅速放入37℃水浴，輕輕搖動凍存管使細胞懸液融化，于超凈臺內將細胞懸液移至10 mL的離心管內，用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養液稀釋至原體積的4倍，1000 rpm離心5 min，棄上清液后加新鮮培養液，輕輕吹打使沉于離心管底部的細胞變為混懸狀態，后將細胞懸液轉移至培養瓶內，將培養瓶放置37℃、5%CO2培養箱內培養，保持較高的細胞密度，用 0.25%胰蛋白酶消化，傳代（觀察細胞生長情況，當細胞鋪滿瓶底或液體變黃，則傳代、更換培養液）。

1.2.2 細胞分組 分組：空白組：無細胞懸液，只添加100μL的培養基;平行對照組：1 mL/L無水乙醇;ATRA組10-5 mol/L ATRA（濃度設定參照相關醫學研究[3]）; L-OHP組1-L-OHP組3的 L-OHP濃度（濃度設定參照相關醫學研究[4]）分別為10mg/L、20mg/L、40mg/L;聯合組1：10-5 mol/L ATRA、10 mg/L L-OHP）、聯合組2：10-5mol/L ATRA、20 mg/L L-OHP;聯合組3：10-5 mol/L ATRA、40 mg/L L-OHP。選取處于對數生長期的人肝癌細胞SMMC-7721，對其經過消化、離心后用含10%標準胎牛血清的DMEM高糖培養基調整到細胞密度為1×105/mL，用加樣槍吸取90μL細胞懸液分別移入到96孔板的9個孔內（此前先用適量的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基鋪底，空白組不加細胞懸液），于37℃、5%CO2培養箱內孵育24 h，確定細胞貼壁并生長狀態良好后，按照上述的分組情況添加對應的試劑和藥物。

1.2.3細胞形態學變化、生長抑制率檢測 觀察細胞形態變化和生長曲線：確定細胞貼壁并生長良好并按照上述的分組情況添加對應的試劑和藥物后，于24h、48 h、72 h時在顯微鏡下觀察細胞形態變化。生長抑制率檢測：采用MTT法進行細胞生長抑制率檢測，分別在24h、48 h、72 h時將5 g/L的MTT溶液20μL加入到9組培養基中，對應的時間段再4h后加入150μL的DMSO振蕩10 min，檢測490 nm處各孔吸光度（A ）值。

1.3統計學方法 用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，若P<0.05，則差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學變化 培養48 h后，平行對照組細胞生長正常;ATRA組部分細胞斷裂、凋亡，細胞間隙增寬;L-OHP組1-L-OHP組3基本相同。聯合組大部分細胞斷裂、凋亡明顯，細胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細胞增加數量并不顯著。

2.2人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用 在培養48 h時，ATRA對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用最明顯，其他各組在這一時期對該細胞的抑制作用也最為明顯。其中，以采用聯合組的抑制作用最為顯著，與單一用藥相比，差異具有統計學意義（P<0.05）;L-OHP組1-L-OHP組3之間的差異無統計學意義（P>0.05）;各聯合組之間的差異無統計學意義（P>0.05），詳見表1和圖1。

3 討論

細胞凋亡（apoptosis）指為了維持機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是一個主動的過程，1972年Kerr等三位科學家首先提出了細胞凋亡這一概念。目前認為，惡性轉化的腫瘤細胞生長失控、增殖過度是產生腫瘤的一個途徑;細胞凋亡受阻，不能進行正常的組織清除是產生腫瘤的另一個途徑。從而導致組織內腫瘤細胞存活延長，使細胞群體內存活與死亡的平衡被破壞，存活大于死亡，腫瘤增長數目的凈增長加大[5]。深入研究細胞凋亡的作用機制，有利于開發相應的抗腫瘤藥物，從而達到阻斷腫瘤發生和發展的可能。目前發現能誘導細胞凋亡的因素也有很多，如射線、藥物等，通過這些因素研究出誘導細胞凋亡而達到抑制腫瘤細胞生長的方法越來越多，用于臨床抗腫瘤的治療手段也越來越豐富，效果越來越好，以誘導細胞凋亡的抗腫瘤藥物也隨之產生而發揮了很好的臨床治療作用。本研究中的藥物試劑全反式維甲酸（Tretinoin， ATRA）可促進腫瘤細胞的分化成熟和凋亡，在提高化療敏感性方面，也具有一定的作用[6]。ATRA是動物體內維生素A的代謝中間產物，是動物肢體再生過程中必不可缺的物質，有著廣泛的生理學和藥理學活性。奧沙利鉑（Oxalipatin， L-OHP）是第三代鉑類抗腫瘤化合物，能促進腫瘤細胞內DNA形成鏈間和鏈內交聯而中斷DNA合成，從而抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[7]。由于兩種藥物對腫瘤細胞作用機制不同，從理論上講，將ATRA與第三代鉑類抗癌化合物奧沙利鉑聯合起來，能夠綜合發揮兩種藥物在人肝癌細胞SMMC-7721抑制方面的優勢作用，從而加強對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制，促進肝癌細胞的破裂和凋亡，進而顯著降低肝癌細胞的數量[8]。

本次研究實驗結果，培養48 h后ATRA組與L-OHP組1- L-OHP組3部分細胞斷裂凋亡;聯合各組細胞明顯減少;但在作用72 h后，各組凋亡細胞無顯著增加。48 h時各組藥物對細胞SMMC-7721的抑制作用最明顯;ATRA聯合L-OHP各組的作用最顯著，與其他組相比，P<0.05;各聯合組之間的差異無統計學意義（P>0.05），和相關醫學[9]研究結果相符。綜合本次實驗的研究數據，驗證了ATRA聯合L-OHP可加強對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用，促進細胞的破裂、凋亡。而聯合用藥的目的為發揮藥物的協同作用以提高療效;延遲和減少耐藥的發生;減少藥物劑量，從而減少藥物不良反應。用于腫瘤的化療藥物中，大部分藥物有較多的不良反應，常見的是胃腸腸道反應（惡心、嘔吐），最嚴重是骨髓抑制。腫瘤化療方案中多采用聯合用藥的方式減少藥物劑量，達到提高療效或（和）減少不良反應的目的。本研究的結果顯示，ATRA聯合第三代鉑類抗癌化合物L-OHP對人肝癌細胞SMMC-7721具有顯著的抑制作用，且聯合組1中較少劑量的L-OHP與其余劑量較高的聯合組對肝癌SMMC-7721細胞的抑制作用相當，無統計學差異，減少藥物用量可達到相同的抑制作用。本文結論可為進一步探討ATRA聯合L-OHP使用治療肝細胞癌提供線索和參考依據，對其是否有確切的臨床意義還需進一步的研究論證。

參考文獻

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