蜘蛛毒素口腔潰瘍散對口腔潰瘍模型大鼠的治療作用及其機制研究

邢國征 王長娜 田旭彤 唐佳美 張玉潔 喬曉強 周程艷

摘 要 目的：研究蜘蛛毒素口腔潰瘍散對口腔潰瘍（RAU）模型大鼠的治療作用及其機制。方法：采用紙片擴散法檢測該散劑的體外抑菌活性。取50只健康SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、陽性組（桂林西瓜霜，100 mg/kg）和口腔潰瘍散高、低劑量組（70、35 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余組大鼠均采用醋酸法在其右側口腔黏膜建立RAU模型。模型成功建立后，各給藥組大鼠分別以相應藥物涂抹潰瘍處，連續給藥3 d；正常組和模型組不作處理。觀察給藥第1、3天時大鼠潰瘍面情況并測定潰瘍面積；取部分潰瘍組織切片觀察其組織形態學變化；檢測大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）、IL-6、干擾素γ（IFN-γ）的水平；采用免疫組化法檢測大鼠潰瘍組織中基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的蛋白表達水平。結果：口腔潰瘍散體外抑菌效果明顯。與空白組比較，模型組大鼠口腔潰瘍明顯，組織病變明顯；血清中TNF-α、IL-1、IL-6、MDA水平均顯著升高，IFN-γ、SOD、GSH水平均顯著降低（P<0.01）；潰瘍組織中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，口腔潰瘍散各劑量組大鼠的潰瘍面積均顯著縮小（P<0.05或P<0.01）或幾近愈合，組織病變明顯減輕；血清中MDA、TNF-α、IL-1、IL-6 水平均顯著降低，SOD、GSH、IFN-γ水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；潰瘍組織中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP表達水平均顯著降低（P<0.01）。結論：蜘蛛毒素口腔潰瘍散具有強效的抑菌、消腫、修復作用，對RAU模型大鼠有明顯的治療作用；其機制可能與降低炎癥因子水平、介導凋亡因子的表達、調節免疫失衡有關。

關鍵詞 口腔潰瘍；蜘蛛毒素；口腔潰瘍散；炎癥因子；凋亡因子；免疫調節；機制；大鼠

Therapeutic Effects of Spider Toxin Oral Ulcer Powder on Oral Ulcer Model Rats and Its Mechanism Study

XING Guozheng，WANG Changna，TIAN Xutong，TANG Jiamei，ZHANG Yujie，QIAO Xiaoqiang，ZHOU Chengyan（College of Pharmacy， Hebei University/Hebei Provincial Key Lab of Drug Quality Analysis and Control， Hebei Baoding 071002， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study therapeutic effects of Spider toxin oral ulcer powder on recurrent aphthous ulcer （RAU） model rats and its mechanism. METHODS： In vitro antimicrobial activity of the powder was determined by disk diffusion method. 50 healthy SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive group （Guilin watermelon frost， 100 mg/kg） and oral ulcer powder high-dose and low-dose groups （70， 35 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for normal group， RAU model was established in the right oral submucosa of rats in other groups by acetic acid method. After modeling， administration groups were smeared with corresponding drugs on ulcers for 3 days. Normal group and model group were not treated. The ulcer surface of rats was observed and the ulcer area was measured on the 1st and 3rd days after administration. The morphological changes of ulcer tissues were observed. The serum levels of SOD， MDA， GSH， TNF-α， IL-1， IL-6 and IFN-γ were detected. The protein expressions of MMP-9， NF-κB， Caspase-3 and PARP in ulcer tissues of rats were detected by immunohistochemistry. RESULTS： The oral ulcer powder showed obvious in vitro bacteriostasis effect. Compared with blank group， oral ulcer and histopathological changes were obvious in model group； serum levels of TNF-α， IL-1， IL-6 and MDA were increased significantly， while the levels of IFN-γ， SOD and GSH were decreased significantly （P<0.01）； the expression of MMP-9， NF-κB， Caspase-3 and PARP in ulcer tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the ulcer area of rats in each dosage group was significantly reduced （P<0.05 or P<0.01） or nearly healed， the pathological changes of tissue were significantly alleviated； serum levels of MDA， TNF-α， IL-1 and IL-6 were decreased significantly， while the levels of SOD， GSH and IFN-γ were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the expression of MMP-9， NF-κB， Caspase-3 and PARP in ulcer tissue were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Spider toxin oral ulcer powder shows strong bacteriostasis， detumescence and repair effects， and has obvious therapeutic effect on RAU model rats. Its mechanism may be related to reducing the level of inflammatory factors， mediating the expression of apoptotic factors and regulating immune imbalance.

KEYWORDS Oral ulcer； Spider toxin； Oral ulcer powder； Inflammatory factor； Apoptosis factor； Immunoregulation； Mechanism； Rat

口腔潰瘍（RAU）是一種常見的潰瘍性損傷疾病，發病率高達20%以上；其發病部位多見于唇黏膜、舌體、頰黏膜、軟腭等，大多呈現圓形或橢圓形潰瘍狀，周圍組織伴有充血水腫現象，直接影響患者的進食、吞咽和語言交流等日常活動[1]。目前研究對RAU的致病機制尚無定論，認為其可能與口腔菌群失調、免疫失衡、精神緊張、維生素缺乏等因素有關[2]。據調查，當今市場上最常用的RAU治療藥物有四環華素片、醋酸地塞米松貼片、養陰生肌散等，但治療效果均有不足[3]，因此臨床亟待有效的相關治療新藥出現。近年來，蜘蛛所分泌的蜘蛛毒素成為生物毒素研究領域的熱點之一，其具有鎮痛、抗菌、抗癌等作用[4]。已有研究發現，蜘蛛毒素對多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及霉菌等均有明顯的抑菌作用[5]。蜘蛛毒素口腔潰瘍散乃沿用民間經典驗方，由蜘蛛（活）、白礬、冰片組方而成[6]，具有祛風、消腫、解毒之功效。本課題組通過研究蜘蛛毒素口腔潰瘍散對實驗性RAU模型大鼠的治療作用，并探討其作用機制，為臨床應用蜘蛛毒素治療RAU提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

BSA2245型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HHCP-T型CO2培養箱（上海賀徳實驗設備有限公司）；DHP-9080型恒溫孵育箱（常州恩培儀器制造有限公司）；ZEISS Primo Start型顯微鏡（德國Zeiss公司）；H2518D型離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）；石蠟包埋機、手動輪轉式石蠟切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy HT型全自動酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 藥品與試劑

自制蜘蛛毒素口腔潰瘍散（以下簡稱為“口腔潰瘍散”，由蜘蛛、白礬、冰片按1 ∶ 4 ∶ 4質量比組方制備：將白礬放于砂鍋內文火加熱至融化，放入新鮮搗碎的蜘蛛煮制，使蜘蛛毒素充分溶解于白礬中，直至白礬變為枯礬時停止加熱，剔除蜘蛛，加入冰片研磨至散狀）；桂林西瓜霜（散劑）（桂林三金藥業股份有限公司，批號：130846，規格：2.5 g）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20160928、20160927、20160929）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫試劑盒、白細胞介素1（IL-1）酶聯免疫試劑盒、IL-6 酶聯免疫試劑盒、干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫試劑盒（江蘇酶標生物科技有限公司，批號均為20180104）；基質金屬蛋白酶9（MMP-9）免疫組化試劑盒、核因子-κB（NF-κB）免疫組化試劑盒、胱天蛋白酶3（Caspase-3）免疫組化試劑盒、二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號均為20170428）；辣根酶過氧化物酶標記兔IgG二抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號：20180405）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，德國進口分裝，批號：020919）；冰醋酸（天津市大茂化學試劑廠，批號：20171101）；注射用生理鹽水（長春豪邦藥業有限公司，批號：S09011301）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2，北京博奧拓科技有限公司）；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為自制無菌蒸餾水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠50只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由北京維通利華生物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養環境溫度為22～25 ℃，相對濕度為55%～70%，12 h光照循環；動物均自由飲水、進食。

1.4 菌株

大腸埃希菌[編號：CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[編號：CMCC（B）26001]均購自北京百歐博偉生物技術有限公司，由中國醫學微生物菌種保藏管理中心提供。

2 方法

2.1 口腔潰瘍散體外抑菌試驗

采用紙片擴散法檢測該散劑的體外抑菌活性[7]。移取無菌蒸餾水、西瓜霜水溶液（10 mg/mL）和高、低質量濃度的口腔潰瘍散水溶液（10、5 mg/mL）各15 μL于 9 mm的圓形濾紙片上。濾紙片烘干滅菌后，分別置于長有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養皿上，于37 ℃培養16 h。采用游標卡尺測量抑菌圈直徑，以確定樣品體外抑菌活性。試驗重復6次。

采用倍比稀釋法測定其最小抑菌濃度（MIC）。將口腔潰瘍散水溶液（20 mg/mL）在96孔細胞培養板上進行倍比稀釋，分別移取各稀釋溶液15 μL，置于長有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養皿上，于37 ℃培養16 h。同時在96孔板中進行相應菌種與藥物的培養。另設不加菌液的空白組。分別測定各孔溶液的光密度（OD），將不同濃度藥物組的OD值與空白組比較，同時結合培養皿菌培養結果，以最接近空白組OD值的對應藥物濃度作為抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的MIC。試驗重復6次。

2.2 動物分組、建模、給藥與取材

取大鼠50只，隨機分為正常組、模型組、陽性組（桂林西瓜霜，100 mg/kg，劑量按人體服用劑量折算后制定）和口腔潰瘍散高、低劑量組（70、35 mg/kg，劑量按該口腔潰瘍散民間常用劑量及《金匱要略》所載蜘蛛散的臨床劑量折算后制定），每組10只。采用醋酸法建立大鼠RAU模型：以3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，在其口腔右側頰部黏膜下注射10%醋酸（0.1 mL/只），24 h后觀察大鼠口腔黏膜形成潰瘍，即RAU模型成功建立；正常組大鼠同法注射等量的生理鹽水。模型成功建立后，陽性組和口腔潰瘍散各劑量組大鼠均用棉簽蘸取相應的藥品涂抹于潰瘍處，每日2次，連續3 d；正常組和模型組大鼠則不作處理。

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，同上麻醉后，于腹主動脈取血，在4 ℃下2 500 r/min離心15 min，取上層血清，于-80 ℃貯存、待用。取血完畢后，取大鼠右側頰部潰瘍處黏膜組織，于4%甲醛中固定、待用。

2.3 大鼠口腔潰瘍面積的測定

參照陳卓等[8]的實驗方法，用游標卡尺測量各組模型大鼠給藥前及給藥后第1、3天時口腔潰瘍的最大橫徑（d1）和最大縱徑（d2），計算潰瘍面積（潰瘍面積=d1×d2×π×1/4，π取值為3.14）。

2.4 大鼠血清中SOD、MDA、GSH水平的檢測

取大鼠血清，按相應試劑盒說明書步驟操作，分別測定血清中SOD、MDA、GSH水平。

2.5 大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ水平的檢測

取大鼠血清，按相應試劑盒說明書步驟操作，以酶聯免疫吸附法檢測血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ水平。

2.6 大鼠口腔潰瘍組織的病理學觀察

取“2.2”項下固定的大鼠口腔潰瘍黏膜組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察其組織病理學變化。

2.7 大鼠口腔潰瘍組織中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP蛋白表達水平的檢測

采用免疫組化SP法進行檢測。按相應試劑盒說明書步驟進行：取“2.6”項下制備的組織切片，脫蠟，PBS沖洗，放入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中加熱修復抗原20 min；自然冷卻，PBS沖洗，滴入3%H2O2，于37 ℃孵育20 min；PBS洗滌，分別滴加MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP一抗（1 ∶ 200），于4 ℃放置12 h；PBS洗滌，滴加二抗（1 ∶ 500），于37 ℃孵育20 min；PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，稀氨水返藍，脫水透明，中性樹脂膠水封片。在顯微鏡下觀察組織切片，按Hercep Test標準評分[9]，判斷各目標蛋白的陽性表達情況。采用Image Pro Plus 6.0軟件測定鏡下陽性染色部位的累積光密度（IOD），以表示蛋白表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 口腔潰瘍散的體外抑菌作用

桂林西瓜霜和不同質量濃度的口腔潰瘍散均在培養皿中形成了抑菌圈，抑菌效果明顯。其中，以高劑量口腔潰瘍散抑菌圈直徑最大。口腔潰瘍散對大腸桿菌金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.25、0.625 mg/mL。桂林西瓜霜和口腔潰瘍散的抑菌圈直徑測定結果見表1，口腔潰瘍散的MIC測定結果見表2。

3.2 各組大鼠口腔潰瘍創面觀察結果

給藥前，與正常組比較，模型組大鼠口腔潰瘍創面明顯，提示RAU造模成功；各給藥組大鼠口腔潰瘍面積較模型組差異無統計學意義（P>0.05）。給藥第1、3天時，模型組大鼠口腔潰瘍面積逐漸縮小；陽性組和口腔潰瘍散各劑量組大鼠的潰瘍面積均較模型組顯著縮小，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。給藥第3天時，正常組大鼠口腔無潰瘍創面，呈現粉紅色平整黏膜，無水腫；模型組大鼠口腔潰瘍創面明顯，呈橢圓形，潰瘍周圍呈凹陷性缺損，周圍組織充血水腫；陽性組和口腔潰瘍散低劑量組大鼠口腔組織凹陷程度有所減輕，口腔黏膜仍能見到充血水腫；口腔潰瘍散高劑量組大鼠口腔潰瘍幾近愈合，組織平整，黏膜充血水腫情況消失。各組大鼠口腔潰瘍面積測定結果見表3。

3.3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ水平檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01），提示RAU造模成功。與模型組比較，陽性組和口腔潰瘍散各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ水平檢測結果見表4。

3.4 各組大鼠血清中SOD、MDA、GSH水平檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH水平均顯著降低，MDA水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01），提示RAU造模成功。與模型組比較，陽性組和口腔潰瘍散各劑量組大鼠血清中SOD、GSH水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清中SOD、MDA、GSH水平檢測結果見表5。

3.5 各組大鼠口腔潰瘍組織病理學觀察結果

鏡下可見，正常組大鼠口腔黏膜為鱗狀上皮覆蓋，組織完整，固有層由致密的結締組織構成，無明顯的炎性細胞浸潤；模型組大鼠口腔黏膜破損，鱗狀上皮脫落，毛細血管擴張，大量炎性細胞浸潤，細胞核破裂，細胞形態改變；陽性組和口腔潰瘍散高劑量組大鼠潰瘍組織病變較模型組明顯減輕，上皮組織趨于完整，炎性細胞浸潤明顯減少，細胞形態幾近恢復正常；口腔潰瘍散低劑量組大鼠潰瘍組織病變程度較模型組減輕，炎性細胞浸潤未見減少，細胞形態略有恢復。各組大鼠口腔潰瘍組織病理學顯微圖見圖1。

3.6 各組大鼠口腔潰瘍組織中 MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP蛋白表達水平檢測結果

鏡下可見，正常組大鼠口腔黏膜組織中未見MMP- 9、NF-κB、Caspase-3、PARP蛋白陽性表達；模型組大鼠口腔黏膜中上述蛋白呈強陽性表達，提示RAU造模成功；口腔潰瘍散高劑量組大鼠口腔黏膜可見上述蛋白的少量陽性表達，陽性組和口腔潰瘍散低劑量組則可見上述蛋白的部分陽性表達。IOD測定結果顯示，與正常組比較，模型組IOD值顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性組和口腔潰瘍散各劑量組的IOD值明顯降低，除口腔潰瘍散低劑量組的MMP-9、NF-κB外，其余指標差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠潰瘍組織中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP蛋白陽性表達顯微圖見圖2～圖5，蛋白表達水平測定結果見表6。

4 討論

RAU是臨床上常見的口腔黏膜疾病，可發病于口腔任何部位，有明顯的灼熱疼痛之感，嚴重影響患者飲食及語言交流，給其生活帶來極大的不便；其致病因素多認為與局部創傷、精神緊張、食物、藥物、激素水平改變及維生素或微量元素缺乏等有關，而遺傳、系統性疾病、免疫、感染、環境等因素也與其發生和發展有著密切的關系[2]。RAU致病機制復雜，目前多采用聯合用藥的方式進行治療，如補充B族維生素、服用左旋咪唑等抗菌藥物及免疫制劑，但治療效果并不理想，而且長期服用抑菌藥物還可能會導致細菌耐藥。研究表明，蜘蛛毒素含有能夠抑制細菌和真菌的抗菌肽，并且具有依賴性低、副作用小、抑菌活性強等優勢[4]，因此本研究采用其制成的散劑進行口腔潰瘍治療效果考察。

桂林西瓜霜為中成藥，與口腔潰瘍散含有部分相同的藥物成分，且此藥為治療RAU的常用藥，臨床應用廣泛、安全性高，故本研究采用其作為陽性對照藥品。在體外抑菌實驗中結果顯示，口腔潰瘍散和桂林西瓜霜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用。大鼠口腔潰瘍創面觀察結果顯示，與模型組比較，口腔潰瘍散高劑量組大鼠的潰瘍面幾近愈合、組織平整，而口腔潰瘍散低劑量組大鼠潰瘍面部分愈合、組織凹陷程度減輕，而且大鼠口腔潰瘍面積均顯著縮小，表明口腔潰瘍散治療大鼠RAU效果確切。

RAU的發生與細胞因子網絡失衡有關，各種細胞因子之間形成復雜的細胞網絡因子[10]，其平衡機制十分復雜。其中，TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ均為重要的炎癥因子，在RAU的發病過程中起著重要的作用。TNF-α在組織損傷時高表達，由單核細胞大量釋放入血，進一步損害黏膜細胞，并能增加口腔血管內皮細胞通透性，引起黏膜固有層水腫[11]。IL-6是由單核巨噬細胞、血管內皮細胞、纖維母細胞和其他細胞對IL-1和TNF-α起反應時所合成，在機體免疫防御功能中起重要作用[12]。也有研究表明，RAU的發病與氧化應激及抗氧化系統的失衡有關。炎癥反應可干擾組織器官內的自由基代謝，促使自由基過度形成，進而導致氧化應激反應和組織細胞損傷[13]。MDA是自由基作用所形成的氧化終產物，可反映組織的損傷程度；而SOD 和 GSH是生物體內重要的抗氧化物質，其變化可反映機體組織的抗氧化能力[14]。此外，RAU的發生發展也被認為與免疫失衡有關。在人體的免疫系統中，NF-κB被認為是免疫系統最重要的轉錄因子，在上皮細胞、黏膜固有層單個核細胞核中高表達[15]；MMPs參加細胞凋亡、傷口愈合等生理進程，還與炎癥、潰瘍等病理進程有關，其中MMP-9為明膠酶，可使層黏連蛋白與Ⅳ型膠原降解，能阻止炎癥擴散與炎性細胞的浸潤[16]。通過激活NF-κB信號通路，可上調MMP-9的表達，加速炎性細胞的浸潤與轉移[17]。Caspase是一類細胞凋亡相關的蛋白酶家族，其中Caspase-3在細胞凋亡中起關鍵作用，一旦被激活，可觸發級聯反應，使凋亡不可避免地發生[18]。此外，Caspase-3還能水解PARP，導致PARP無法正常參與DNA的損傷修復，從而誘導細胞凋亡[19]。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、MDA水平均顯著升高，IFN-γ、SOD、GSH水平均顯著降低，潰瘍組織中MMP-9、NF- κB、Caspase-3、PARP表達水平均顯著升高，表明RAU造模成功。與模型組比較，陽性組和口腔潰瘍散各劑量組大鼠血清和潰瘍組織中上述指標均顯著改善，大部分指標差異有統計學意義。

綜上所述，蜘蛛毒素口腔潰瘍散具有強效的抑菌、消腫、修復作用，對RAU模型大鼠有明顯的治療作用；其機制可能與降低炎癥因子水平、介導凋亡因子的表達、調節免疫失衡有關。

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（收稿日期：2018-11-06 修回日期：2019-03-06）

（編輯：段思怡）