川芎飲片的HPLC指紋圖譜建立、聚類分析及偏最小二乘判別分析

石海培 包貝華 黃勝良 汪國強 左武朋 嚴輝 張麗

摘 要 目的：建立川芎飲片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行聚類分析和偏最小二乘判別（PLS-DA）分析。方法：采用HPLC法，色譜柱為Waters Symmetry C18，流動相為乙腈-0.5%醋酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。以藁本內酯為參照，繪制21批樣品（S1～S21）的HPLC圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版）進行相似度評價，確定共有峰；采用SPSS 19.0軟件進行聚類分析，并結合PLS-DA分析區分樣品。結果：21批樣品的HPLC圖譜有25個共有峰，并指認了其中9個共有峰；相似度為0.769～0.989，其中基地、傳統藥用部位樣品（S1～S10）相似度均大于0.970。21批樣品可聚為3類，S1～S10聚為一類，S15～S16、S19～S20聚為一類，其余聚為一類。PLS-DA分析確定了11個分類標志物，并指認了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A等5個色譜峰，這5個色譜峰可有效區分非市售、基地樣品（S1～S10）與市售、非基地樣品（S11～S21），與聚類分析結果一致。結論：所建指紋圖譜、聚類分析及PLS-DA分析結果可為川芎飲片的質量評價提供參考。

關鍵詞 川芎；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析；偏最小二乘判別分析

Establishment of HPLC Fingerprint， Cluster Analysis and PLS-DA of Ligusticum chuanxiong Decoction Pieces

SHI Haipei1，BAO Beihua1，HUANG Shengliang2，WANG Guoqiang2，ZUO Wupeng2，YAN Hui1，3，ZHANG Li1，3（1. School of Pharmacy， Nanjing University of TCM， Nanjing 210023， China. 2. Jiangsu Rongyu Pharma- ceutical Co.， Ltd.， Jiangsu Huai’an 223001， China； 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Ligusticum chuanxiong decoction pieces， and to conduct cluster analysis and PLS-DA analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5% acetic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using ligustilide as control， HPLC chromatograms of 21 batches of samples （S1-S20） were determined. The similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） to determine common peak. Cluster analysis was conducted by using SPSS 19.0 software and PLS-DA was used to distinguish the samples. RESULTS： There were 25 common peaks in HPLC chromatograms for 21 batches of samples， and 9 common peaks were identified. The similarity of samples was between 0.768-0.989， and the similarity of base and traditional medicinal part samples （S1-S10） were more than 0.970. The 21 batches of samples were clustered into 3 categories， in which S1-S10 were category Ⅰ； S15-S16， S19-S20 were category Ⅱ； other were category Ⅲ. By PLS-DA analysis， 11 classification markers were identified as well as 5 chromatogram peaks were identified， such as ferulic acid， pine cyperyl ferulate， n-butyl phthalide， ligustilide， ligustilide A， which could be used to distinguish base and non-markted samples （S1-S10） from marketed and non-base samples （S11-S21）， which were consistent with the results of cluster analysis. CONCLUSIONS： Established fingerprint， cluster analysis and PLS-DA analysis can provide reference for quality evaluation of L. chuanxiong decoction pieces.

KEYWORDS Ligusticum chuanxiong； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； PLS-DA

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，原名芎[窮] [1]，主產于四川彭州、都江堰、什邡等地[2]。川芎辛溫，具有活血行氣、祛風止痛的功效[3]。有研究報道，川芎含有苯肽類[4-5]、有機酸類[5-6]、多糖類[5-7]、生物堿類[5-6]等成分，具有抗血小板聚集[2，8]、抗血栓形成[9]、止痛[7]等作用。

川芎作為新生化顆粒的重要原料，旨在活血行氣、去除體內淤血，其飲片質量的穩定、優質與新生化顆粒的質量息息相關，故有必要對川芎飲片的質量進行全面、綜合的評價。2015年版《中國藥典》（一部）以水溶性成分阿魏酸的含量作為川芎質量控制的指標[3]。雖然也有學者對川芎中的多種成分同時進行了定量分析[10-11]，但仍無法全面地評價川芎飲片的質量。

中藥指紋圖譜具有整體性、相似性的特點，能突出中藥的完整面貌，可依據相似度的特點實現對中藥內在化學成分的綜合評價和整體質量的全面控制[12]。近年來，已廣泛用于藥材飲片的質量評價[13-14]。為此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立了21批樣品的指紋圖譜，并采用聚類分析和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對川芎飲片進行綜合評價，同時結合模型變量投影（VIP）參數區分各批樣品，以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695-2998型HPLC儀，包括四元高壓溶劑管理系統、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、真空脫氣機、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；MS-105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；D3024型臺式高速微量離心機（美國Scilogex公司）；XFB-200型高速中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；KH-500DB型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，純度：≥99%）；綠原酸對照品（批號：Y24J7K16726，純度：≥98%）、阿魏酸松柏酯對照品（批號：Z02S8B42740，純度：≥98%）、洋川芎內酯A對照品（批號：P31AIF42747，純度：≥98%）均由上海源葉生物科技有限公司提供；洋川芎內酯I對照品（批號：JBZ- 1468，純度：≥98%）、洋川芎內酯H對照品（批號：JBZ- 1467，純度：≥98%）、正丁基苯酞對照品（批號：JBZ- 1641，純度：≥98%）、丁烯基苯酞對照品（批號：JBZ- 0285，純度：≥98%）、藁本內酯對照品（批號：JBZ-0405，純度：≥98%）均由南京金益柏生物技術有限公司提供；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；冰乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水甲酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；水為超純水。

1.3 藥材

共收集21批樣品，經南京中醫藥大學藥學院嚴輝副教授鑒定為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖。樣品來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%A→45%A；25～35 min，45%A→55%A；35～45 min，55%A；45～55 min，55%A→95%A；55～60 min，95%A；60～65 min，95%A→5%A）；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、藁本內酯、丁烯基苯酞對照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，得單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加乙腈定容至刻度，制成含綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、藁本內酯、丁烯基苯酞質量濃度分別為48.60、45.60、47.60、36.50、53.30、55.73、202.70、591.20、32.10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加5%甲酸甲醇溶液25 mL，稱定質量，超聲（功率：250 w，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，用5%甲酸甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S9）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以藁本內酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，25個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.7%（n=6），相對峰面積的RSD均小于4.2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S9）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以藁本內酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，25個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5.3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取樣品粉末（編號：S9）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以藁本內酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，25個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5.7%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取21批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版）對各批樣品的HPLC指紋圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版）對樣品進行相似度分析，以傳統藥用部位18批樣品（編號：S1～S10、S14～S21）為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，21批樣品的相似度為0.769～0.989，其中市售、非基地、非傳統藥用部位樣品（編號：S11～S13）相似度為0.848～0.872，表明其與非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）比較，兩者的化學成分存在一定差異。編號為S21批樣品相似度僅為0.769，主要為綠原酸、9號峰、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯峰的峰面積差異較大導致。18批樣品（編號：S1～S10、S14～S21）中，除S17、S18、S21批樣品相似度較低（<0.90）外，其余15批樣品相似度均大于0.90，表明部分市售、非基地、傳統藥用部位樣品（編號：S14～S16、S19～S20）與非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）具有較好的相似性，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 21批樣品共有25個共有峰，通過與混合對照品溶液HPLC圖（見圖3）對比，指認出5號峰為綠原酸、8號峰為阿魏酸、10號峰為洋川芎內酯I、11號峰為洋川芎內酯H、14號峰為阿魏酸松柏酯、16號峰為洋川芎內酯A、17號峰為正丁基苯酞、21號峰為藁本內酯、22號峰為丁烯基苯酞。由于藁本內酯峰（21號峰）信號強、峰形好，故以其保留時間和峰面積為參照，計算其他峰相對于藁本內酯峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3～表6。

2.5 聚類分析

以各共有峰的絕對峰面積為指標，采用SPSS 19.0軟件，結合平均連接法以歐氏距離為測度進行聚類分析，詳見圖4。由圖4可知，21批樣品可聚為3類：S1～S10聚為一類，S15～S16、S19～S20聚為一類，其余聚為一類。S15～S16、S19～S20批樣品與10批非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）距離接近，與相似度評價結果基本一致。

2.6 PLS-DA分析

對21批樣品進行PLS-DA分析，以25個共有峰的峰面積（X）為自變量、樣品（Y）為因變量，繪制PLS-DA模型得分圖，詳見圖5。由圖5可知，非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）集中分布在模型得分圖的左側，其余樣品（編號：S11～S21）零散分布在右側；S15～S16、S19～S20聚為一類，與非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）距離較近，該結果與聚類分析、相似度評價結果基本一致。PLS-DA模型中變量的解釋度（R2Y） =0.930，模型的預測度（Q2）=0.869，均接近1，表明所建模型可靠。進一步對模型變量投影（VIP）進行分析，篩選影響樣品分類的變量色譜峰，以VIP>1為篩選標準，共得到貢獻相對較大的11個變量色譜峰，依次為14號峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）、17號峰（正丁基苯酞，VIP=1.533）、21號峰（藁本內酯，VIP=1.516）、16號峰（洋川芎內酯A，VIP=1.468）、18號峰（VIP=1.453）、23號峰（VIP=1.453）、20號峰（VIP=1.316）、3號峰（VIP=1.231）、19號峰（VIP=1.187）、9號峰（VIP=1.055）、8號峰（阿魏酸，VIP=1.032），詳見圖6。

2.7 分類標志物相對峰面積比值分析

以變量色譜峰作為分類標志物，得到11個分類標志物，其中14號峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）VIP值最大。進一步比較非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10），市售、非基地、非傳統藥用部位樣品（編號：S11～S13），市售、非基地、傳統藥用部位樣品（編號：S14～S21）中16號峰（洋川芎內酯A）與14號峰的相對峰面積比值，分別為0.450±0.018、1.685±0.172、1.625±0.848；17號峰（正丁基苯酞）與14號峰的相對峰面積比值分別為0.019±0.002、0.103±0.005、0.072±0.036；21號峰（藁本內酯）與14號峰相對峰面積比值分別為1.663±0.062、5.195±0.529、6.177±3.544。這提示，分類標志物的相對峰面積比值可進一步明顯區分非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）與市售、非基地、非傳統藥用部位樣品（編號：S11～S13）及市售、非基地、傳統藥用部位樣品（編號：S14～S21）。

3 討論

本研究建立的HPLC指紋圖譜能較好地反映川芎飲片的整體特征，并指認出9個共有峰，分別為綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、藁本內酯、丁烯基苯酞。

筆者在前期試驗中，將供試品溶液于全波長（190～400 nm）掃描，發現在254、280 nm波長下色譜圖基線較平穩，色譜峰數目相當，但在280 nm波長下參照峰（藁本內酯峰）響應較高，故選擇254 nm為檢測波長。筆者參考相關文獻[15]，發現阿魏酸松柏酯峰在乙腈、5%甲酸甲醇溶液中相對穩定，故以此為提取溶劑進行考察；同時又比較了不同超聲時間（30、45、60 min）、不同色譜柱（Waters Symmetry C18、Hanbon Sci & Tech）對色譜行為的影響，結果以Waters Symmetry C18為色譜柱、5%甲酸甲醇溶液為提取溶劑、超聲處理30 min時，色譜峰峰形較好、色譜峰數目相對較多。

相似度評價、聚類分析、PLS-DA分析結果顯示，市售、非基地、傳統藥用部位樣品（編號：S15～S16、S19～S20）的相似度與非市售、基地、傳統藥用部位樣品（編號：S1～S10）較為接近。VIP分析得到11個分類標志物，通過與混合對照品比對，指認了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本內酯、洋川芎內酯A等5個色譜峰，這5個色譜峰可有效區分非市售、基地樣品與市售、非基地樣品；而對于其他未明確的成分，仍有待后續研究進一步探討。

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（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2019-02-22）

（編輯：陳 宏）