蒙藥山川柳的HPLC指紋圖譜建立、相似度評價和聚類分析

鈕松召 崔穎 盧菲 徐鵬程 孫超

摘 要 目的：建立蒙藥山川柳的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行相似度評價和聚類分析。方法：采用HPLC法，色譜柱為Agilent ODS C18，流速為1.0 mL/min，流動相為甲醇-水（梯度洗脫），檢測波長為335 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。以槲皮素峰為參照，生成10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）進行相似度評價，確定共有峰；采用SPSS 17.0 軟件對10批藥材樣品進行聚類分析。結果：10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜有13 個共有峰，相似度大于0.95，并指認了槲皮素和山柰酚這2個共有峰。聚類分析結果顯示，10批藥材樣品可聚為兩類，S8聚為一類，其余批次聚為一類。結論：所建HPLC指紋圖譜、相似度評價和聚類分析結果可為山川柳藥材的質量控制提供依據(jù)。

關鍵詞 山川柳；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度；聚類分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Mongolian Medicine Ramulus Tamarix and Similarity Evaluation and Cluster Analysis

NIU Songzhao1，CUI Ying1，LU Fei1，XU Pengcheng1，SUN Chao2（1. College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China； 2. Dept. of Pediatric Orthopaedics， the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Mongolian medicine Ramulus Tamarix， and to conduct similarity evaluation and cluster analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ODS C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 335 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using quercetin peak as reference， HPLC fingerprint of 10 batches of medicinal sample were drawn. Similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004 A） so as to confirm common peak. SPSS 17.0 software was used for cluster analysis of those samples. RESULTS： There were 13 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of samples， and the similarities of them were all greater than 0.95； 2 common chromatographic peaks of quercetin and kaempferol were identified. Results of cluster analysis showed that 10 batches of samples were classified into 2 classes. S8 was clustered into one class； other were clustered into another class. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and results of similarity evaluation and cluster analysis can provide reference for quality control of R. Tamarix.

KEYWORDS Ramulus Tamarix； HPLC； Fingerprint； Similarity； Cluster analysis

山川柳（Ramulus Tamarix.）系檉柳科（Tamaricaceae）植物，蒙藥名為蘇海，別名為奧恩布，其藥用部位為嫩枝葉。山川柳作為蒙藥傳統(tǒng)藥材，性涼，味澀、甘，具有清熱、透疹、斂毒等作用[1] 。其主要含檉柳酚、檉柳酮、檉柳醇、總黃酮二甲醚、三十二烷醇己酸酯等化學成分[2-3]，臨床上用于治療小便不通暢、麻疹不透、皮膚癢疹、慢性風濕病等[2，4]。

山川柳又稱西河柳[5]，在2015年版《中國藥典》（一部）中西河柳質量標準僅有理化鑒別、薄層色譜鑒別及水分、灰分檢查等項目[6]。在《蒙藥質量標準化研究》中也僅記載了其來源、名稱、性狀、水分、灰分及浸出物測定等[7]，但鮮見對其質量標準的進一步研究，也未見其指紋圖譜研究的報道。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了10批山川柳藥材樣品的指紋圖譜，以完善其質量標準，為該藥材的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國 Agilent公司）；R-1001N型旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；AB135-S型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；JA5003N型千分之一電子天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 試劑

槲皮素對照品（批號：100081-201608，純度：98%）、山柰酚對照品（批號：110861-201610，純度：98%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，美國Fi- sher公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批山川柳藥材（內蒙古天立藥業(yè)公司，批號：20150408、20150509、20160308、20160609、20160808、20161009、20161208、20170209、20170508、20170708，編號：S1～S10），經(jīng)內蒙古醫(yī)科大學藥用植物教研室喬俊纏教授鑒定為檉柳科（Tamaricaceae）檉柳屬（Tamarix Linn.）山川柳（Ramulus Tamarix.）的枝葉。藥材經(jīng)粉碎后過20目篩，于干燥陰涼處保存。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ODS C18（250 mm×4.6 mm ，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：335 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；洗脫時間：75 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取槲皮素對照品1.06 mg、山柰酚對照品1.51 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得單一對照品貯備液。分別精密量取上述各單一對照品貯備液3、2 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液，避光保存。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末2.0 g，精密稱定，置于雞心瓶中，加90%乙醇40 mL、3%鹽酸10 mL ，于70 ℃回流提取1.5 h。取出，放至室溫，濾過，加90%乙醇定容于50 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S5）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以槲皮素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S5）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品粉末（編號：S5）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版），以樣品的HPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批藥材樣品相似度在0.951～1之間，均大于0.95，表明藥材樣品化學成分一致性較高，穩(wěn)定性較好，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 10批藥材樣品共有13個共有峰，其峰面積合計占色譜峰總面積的90%以上，詳見表3。通過與混合對照品的HPLC圖（見圖3）對比，指認8號峰為槲皮素，10號峰為山柰酚。由于槲皮素（8號峰）色譜峰的峰面積穩(wěn)定、保留時間適中，且峰形較好，故以槲皮素峰的保留時間和峰面積為參照，計算其他峰的相對保留時間、相對峰面積，詳見表4、表5。

2.5 聚類分析

以各共有峰峰面積為變量，采用SPSS 17.0 軟件，以Ward法結合平方歐式距離對10批藥材樣品進行聚類分析，詳見圖4。由圖4可知，10 批藥材樣品可聚為兩類，S8聚為一類，其余批次聚為一類。

3 討論

筆者前期參考相關文獻[8-14]，比較了以甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%醋酸水溶液、甲醇-水為流動相時的色譜峰情況，結果發(fā)現(xiàn)酸的濃度及種類對色譜峰形和出峰個數(shù)等影響不大。以甲醇-水為流動相時，色譜峰形尖銳對稱，基線較平穩(wěn)，不易漂移，出峰個數(shù)多且穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析，故選擇甲醇-水為流動相進行梯度洗脫。筆者又通過考察260、295、335、340、355 nm等不同檢測波長下的色譜圖，結果發(fā)現(xiàn)檢測波長為335 nm時，色譜峰的分離度大于1.0，出峰個數(shù)多，故選擇335 nm為檢測波長。

筆者通過比較超聲提取和回流提取兩種提取方式對提取效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)回流提取時的分離效果較好，峰形對稱，峰面積較大，分離度適中，故選擇回流提取。此外，筆者還比較了以乙醇、甲醇為提取溶劑時對峰形的影響，結果發(fā)現(xiàn)以兩種提取溶劑所獲峰形差別不大，但考慮到乙醇毒性更小，故選擇乙醇為提取溶劑；同時也發(fā)現(xiàn)，90%乙醇與無水乙醇無明顯差異，為了節(jié)省成本，故最終選擇90%乙醇為提取溶劑。

10批藥材樣品共有13個共有峰，并指認了其中2個共有峰，分別為槲皮素、山柰酚。相似度評價結果顯示，10批藥材樣品的化學成分整體上一致性較高，但峰面積RSD差異較大，各批藥材樣品含量存在一定的波動性。聚類分析結果顯示，10批藥材樣品可聚為兩類，S8聚為一類，其余批次聚為一類，但考慮到相似度均大于0.95，可認為S8藥材樣品的化學成分與其他9批藥材樣品的化學成分有較高的一致性，只是受產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境和采收時間等因素影響而產(chǎn)生一定的波動。

綜上所述，本文所建立HPLC指紋圖譜、相似度評價和聚類分析結果可為山川柳藥材的質量控制提供參考。

參考文獻

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（收稿日期：2018-11-12 修回日期：2019-02-23）

（編輯：陳 宏）