中藥石香膏對糖尿病大鼠糖尿病潰瘍創面中AGEs、VEGF、CD34含量影響的研究

周一夫 費冀 張開偉 凌一鳴 沈馮君

[摘要]目的：研究中藥石吞膏對大鼠糖尿病潰瘍的愈合作用及對潰瘍創面肉芽組織中晚期糖基化終末產物（AGEs）、血管內皮生長因子（VEGF）、高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（CD34）含量，從分子水平來探討中醫藥促進創面修復的機理，為糖尿病潰瘍的預防及治療的進一步研究提供理論依據。方法：將40只清潔SD大鼠隨機分為4組，為正常對照組、陽性對照組、貝復濟組、石香膏組，每組每時間點（7d/14d）5只。造模成功后，貝復濟組創面以貝復濟噴濕紗布覆蓋，石香膏組創面外敷石香膏。第7門4天，取大鼠背部創面肉芽組織標本，IHC法檢測各組大鼠背部創面樣本（肉芽組織）中的AGEs、VEGF、CD34。結果：（1）7天的樣本，與正常對照組對比，陽性對照組含量明顯上調，貝復濟組含量明顯上調、石香膏組的AGEs的含量明顯下調，與陽性對照組比較，各給藥組AGEs的表達下調;與石香膏組比較，貝復濟組的AGEs含量。14天時間點的樣本，與正常對照組對比，陽性對照組、貝復濟組、石吞膏組的AGEs的含量明顯上調，與難愈合組比較，各給藥組AGEs的表達下調，與石吞膏組比較，貝復濟組的AGEs、含量上調：（2）在7天與14天時間點的樣本與正常對照組對比，陽性對照組VEGF、CD34含量下調，貝復濟組、石吞膏組VEGF、CD34的含量明顯上調，與陽性對照組比較，各給藥組的VEGF、CD34明顯含量上調：與石吞膏組比較，貝復濟組的VEGF、CD34表達下調。結論：使用石吞膏對于糖尿病潰瘍創面的治療，能夠明顯抑制AGEs，并促進VEGF、CD34表達上調對于創面修復具有顯著促進作用。

[關鍵詞]石香膏;糖尿病潰瘍治療;AGEs、VEGF、CD34

[中圖分類號]R285[文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）07-016-06

創面愈合過程是復雜的，包括了組織學、內分泌學和生物力學等一整套動態過程，影響其過程的因素包括整個機體和局部情況。糖尿病潰瘍作為其最常見并發癥之一，給患者個人以及全社會都帶來了嚴重負面影響。我國糖尿病患者不僅數量驚人，且患病率也高于全球平均水平，在2017年高達10.9%。在糖尿病患者中大約15%到25%皮膚因各種因素潰瘍，且病情常常反復，長時間難以愈合，嚴重者會導致截肢甚至引發膿毒血癥而危及生命。在全國名老中醫沈馮君教授的經驗基礎上，貴州中醫藥大學附屬醫院院內制劑“石香膏”通過長期的臨床應用觀察到對于糖尿病潰瘍的治療具有良好效果，且已經進行了大量相關基礎研究得出了石香膏有促進了提高bFGF等生長因子的表達，使創面肉芽組織加快了生長速度從而縮短創面愈合時間。本研究通過建立糖尿病潰瘍大鼠模型，根據AGEs、VEGF、CD34含量來研究石香膏外用于糖尿病潰瘍創面的治療以及相關機制，為該藥更深層次研究以及臨床應用提供相關的實驗基礎。

1 實驗材料

1.1實驗動物;采用SD大鼠40只，體重300g-350g，要求清潔級且為雄性。由貴州醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證征號：SCXK（黔）2012-0001，許可證證號：SYXK（黔）2012-0001，在常溫下于貴州醫科大學實驗動物中心實驗室分籠喂養。

1.2實驗動物分組及飼養：40只清潔劑雄性SD大鼠（由貴州醫科大學動物中心提供）飼養在貴州醫科大學動物中心，實驗室溫度盡量保持在25℃，濕度大約為50%，明暗周期12小時，不限制進食飲水，先通過適應性喂養，在3周稱重。隨機分為5組，共設2時間點（分別為造模后7d/14d），每組每時間點5只，共40只。（本實驗場地以及動物飼料均由貴州醫科大學動物實驗室中心提供）

1.3實驗主要藥品、試劑、化學藥品、耗材：石香膏（貴陽中醫學院第一附屬醫院中藥制劑室制備）、重組牛堿性成纖維細胞成長因子（貝復濟）（珠海億勝生物制藥有限公司）、檸檬酸鈉緩沖液（上海遠慕生物有限公司）、鏈脲佐菌素（上海遠慕生物有限公司）、水合氯醛（上海化學試劑采購供應五聯化合廠）、注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）、一抗：AGEs（美國）、一抗：VEGF（美國）、一抗：CD34（兔來源）abeam（美國）、一抗稀釋液（中國）、二抗稀釋液（中國）、HRP標記的二抗（美國）、PBS（中國）、DAB（中國）、H202（中國）、酒精（中國）、二甲苯（中國）、蘇木素（中國南京）、中性樹膠（中國北京）、多聚甲醛（中國上海）、TritonX-100（中國上海）、山羊血清（USA）

1.4實驗試劑制備：（1）PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑每袋加ddH20定容至1000mL，調pH7.2，121℃，30min，高壓滅菌，4℃保存。（2）4%多聚甲醛固定液：4g多聚甲醛，50-80ml PBS，加熱至60℃，持續攪拌至完全溶解，定容100ml，4℃保存。（3）另外，準備雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、蘇木素。

1.5實驗儀器：血糖儀（德國貝朗）、電熱壓力蒸汽消毒器（YXQ-LS-100A）（上海博訊實業有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（中國上海）、電子分析天平（瑞士）、倒置顯微鏡（日本）、純水儀（USA）、切片機（德國）、展片機（德國）、烤片機（德國）

0.6分析軟件：Image-pro-plus 6.0、SPSS23.0

2 研究方法

2.1造模及模型評價

2.1.1建立誘導糖尿病大鼠模型及模型評價：造模前18h禁食，自由飲水;于造模當日，對隨機30只大鼠（日后分為陽性對照組、石香膏組、貝復濟組）以電子稱稱取體重，以血糖儀測得尾部采血而得出基礎血糖值;接下來使用pH為4.0的0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解STZ配制成1%濃度，根據65mg/kg體重，對大鼠注射STZ溶液，3天后檢測其隨機血糖，當測得大于16.7mmol/L時，為糖尿病模型。（測得血糖大于33.3mmol/L時可以使用諾和靈R 1-4U/d，以控制血糖，提高實驗數據準確性），而隨機10只大鼠作為正常對照組大鼠僅注射濃度為0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。

2.1.2建立糖尿病潰瘍大鼠模型：注射一周后，剃去4組大鼠背部毛發，予以硫化鋇再次脫毛，根據3ml/KG體重腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后造模區（腰椎正中偏上）備皮，以標準無菌操作根據圓形區域剪除表皮層、真皮層以及皮下，造成與深層筋膜外界相通的創口即造模成功。待止血后，對創面用雙層生理鹽水浸潤無菌紗布加雙側兩層無菌干紗布固定。為預防感染，對所有大鼠連續注射青霉素，時間為術前一天開始總共4天，用量按照4000U/只。隨后分籠防止互相破壞傷口，并予充足飲水飼料。

2.1.3動物用藥：除正常對照組共10只之外，剩余已建立糖尿病潰瘍模型的30只大鼠。造模成功1周后再進行隨機分組：陽性對照組10只、石香膏組10只、貝復濟組10只，石香膏組大鼠使用石香膏均勻涂抹消毒紗布上厚度約2mm，對創面完全覆蓋，再以消毒醫用紗布覆蓋固定;貝復濟組使用貝復劑完全浸透紗布，按創面大小剪成小塊貼于創面上達到完全覆蓋，隨后加蓋兩層消毒干紗布固定。陽性對照組及正常對照組僅使用雙側消毒干紗布覆蓋固定。石香膏組、貝復濟組每日換藥，正常組對照及陽性對照組則更換消毒紗布覆蓋。

2.1.4標本采集：用藥后的第7天、14天分別對大鼠注射麻醉（使用10%水合氯醛），取背部創面肉芽組織作為標本。一部分標本使用10%甲醛溶液固定后，制成石蠟塊保存;另一部分使用干冰達到-70℃條件保存。

2.2IHC檢測各組大鼠背部創面肉芽組織中AGEs、VEGF、CD34含量

2.2.1實驗原理：免疫組化是根據抗原與抗體的特異性結合原理，來定位、定性及定量組織細胞當中的抗原。

2.2.2實驗方法

2.2.2.1組織石蠟制作：（1）用PBS清洗，4%多聚甲醛固定;（2）脫水;（3）透明;（4）透蠟;（5）包埋;（6）切片;（7）烤片。

2.2.2.2石蠟切片脫蠟復水：（1）脫蠟：將石蠟切片分別浸泡于二甲苯I、二甲苯II和1/2二甲苯中，各10min。（2）復水：將脫蠟后的石蠟切片浸泡于100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中，各5min。（3）雙蒸水清洗3次，每次2min。（4）PBS漂洗，3x2min;

2.2.2.3抗原熱修復：是以高溫、高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。

2.2.2.4免疫組化：（1）在切片組織上滴加0.5%TritonX-100室溫打孔20min，PBS浸洗切片3次，每次3min。（2）3%H202處理（室溫）15min，PBS浸洗切片3次，每次3min。（3）山羊血清室溫封閉60min。（4）取出甩于封閉液;一抗孵育（VEGF稀釋比1：200，CD34稀釋比l：200，AGEs稀釋比1：400），4℃過夜。（5）PBS清洗標本3次各5min。（6）二抗孵育37℃ 30min。（7）PBS清洗標本。（8）DAB顯色。（9）蒸餾水。（10）蘇木素復染。（11）水洗返藍。（12）梯度酒精脫水。（13）二甲苯透明。（14）中性樹膠封片。

2.2.3免疫組化圖像分析：應用顯微圖像采集系統對免疫組化圖像進行攝片。隨后使用IPP 6.0圖像分析軟件操作并得出平均光密度值（MOD）

2.2.4統計學處理：應用SPSS23.0統計軟件的單因素方差分析功能，以及對組間比較的成組，檢驗功能（設定P<0.05表示有統計學意義）。對得出的數據采用平均值（X+S）表示。

3 結果

3.1實驗造模的評價：用血糖儀測定基礎血糖全部低于16.7mmol/L;隨后陽性對照組、石香膏組、貝復濟組共30只大鼠，按方法注射SIZ溶液，未發生大鼠死亡。3天后測定隨機血糖全部大于167毗且小于333mmol/L，表明制作糖尿病模型成功。

3.2IHC檢測各組大鼠背部創面肉芽組織中AGEs、VEGF、CD34含量結果

3.2.1各組大鼠背部創面肉芽組織中AGEs的含量：7天的樣本，與正常對照組對比，陽性對照組含量明顯上調（P<0.05），貝復濟組含量明顯上調（P<0.05）、石香膏組的AGEs的含量明顯下調（P<0.05）。與陽性對照組比較，各給藥組AGEs的含量下調（P<0.05）;與石香膏組比較，貝復濟組的AGEs含量上調P<0.05）。14天時間點的樣本，與正常組對比，陽性對照組、貝復濟組、石香膏組的AGEs的含量明顯上調（P<0.05），與陽性對照組比較，各給藥組AGEs的含量下調（P<0.05），與石香膏組比較，貝復濟組的AGEs含量上調（P<0.05）結果見表1，圖1一圖8。

3.2.2各組大鼠背部創面肉芽組織中VEGF的含量：在7天與14天時間點的樣本與正常對照組對比，陽性對照組含量下調（P<0.05），貝復濟組、石香膏組VEGF的含量明顯上調（P<0.05），與陽性對照組比較，各給藥組的明顯含量上調（P<0.05）;與石香膏組比較，貝復濟組的VEGF含量下調（P<0.05）。結果見表2，圖8-圖16。

3.2.3各組大鼠背部創面肉芽組織中CD34的含量：在7天與14天時間點的樣本與正常對照組對比，陽性對照組含量下調（P<0.05），貝復濟組、石香膏組CD34的含量明顯上調（P<0.05），與陽性對照組比較，各給藥組的明顯含量上調P<0.05）;與石香膏組比較，貝復濟組的CD34含量下調（P<0.05L結果見表3，圖17-圖24。

4討論與結論

4.1討論

糖尿病潰瘍屬于的祖國醫學中“癰疽”。“癰疽”的病機為臟腑出現功能障礙及某些致病的因素侵襲人體，造成邪毒滯的留滯，從而導致氣血聚集不流通，最后出現瘀血凝滯而肌肉、氣血腐壞。病機以熱瘀為主《黃帝內經》所云：“營氣不從，逆于腠理，乃生癰腫”。對“癰疽”的治療及理論研究經過長期的實踐與探索，從而形成了“提膿祛腐”和“煨膿長肉”的創新性理論體系。前者正是依據《靈樞.癰疽》日：“肉腐則為依據，腐不去則新肉不生”的理論，對于腐肉緩慢的不脫或脫從而影響到新肉的生長恢復，采用如丹類具有提膿祛腐的藥物，使瘡瘍中積蓄不暢的膿毒可以早日排出，使腐肉得以快速脫落，稱為追蝕法。此治療法重點在于“腐”，排出腐、膿等有形之邪為首要目的，如邪不去，則易生熱，熱生則肉腐，肉腐轉化為膿，瘡瘍于是經久難愈。后者是指在瘡瘍愈合的腐去肌生和肌平皮長階段，外用中藥的膏（散）劑，目的讓藥物經過皮膚以及瘡面吸收，促進局部氣血運行使其通暢，增強瘡瘍處抗病能力，目的使瘡口滲出較多的膿液，以此保持瘡面的濕潤，起到調節患處氣血，促進局部組織快速生長，減少瘢痕的作用。瘡面愈合后期的膿之來必由氣血，故為局部氣血旺盛正常產生的代謝產物，以此可理解為：“偎者，用法溫也，膿者，實為氣血也。”是指溫經通絡使局部氣血旺盛，達到瘡口滲出增多以保持瘡面濕潤的目的，重點在于強調溫度和濕度對創面修復愈合的重要。

4.1.1中藥“石香膏”的方組及現代藥理學研究

中藥“石香膏”是由乳香、沒藥、赤石脂、梔子等藥物調制而成。方中乳香、沒藥均能活血定痛，消腫生肌，在近年廣泛運用含乳香、沒藥方劑當中，其中生肌散用于局部外敷治療瘡瘍臨床療效顯著，化腐止痛以及生肌收口效果良好。同時對于重度褥瘡的治療，其效果顯著優于常規的褥瘡治法，明顯起到了加快創面愈合以及促進組織修復的作用。赤石脂的功效在于止血生肌，并能收濕斂瘡;梔子清熱利濕，涼血解毒;已有因促進潰瘍面愈合作用而運用赤石脂的潰瘍散在治療深部膿腫、手足部化膿性感染，、下肢慢性潰瘍等，取得了促進潰瘍愈合的滿意療。

4.1.2糖尿病潰瘍的現代醫學治療

創面修復是一個包括凝血過程、組織增殖等一系類復雜過程。包括再生、修復、重建，對患處進行修補。糖尿病患者因為長期處于高血糖狀態下，易生成AGEs（Advancedglycation end products，糖基化終末產物），此物質為體內蛋白在非酶糖化和氧化反應下與還原糖結合形成的結構，對創面愈合有抑制作用。由于AGEs在各種細胞中的積累，細胞結構和功能可能會隨著RAGE的參與而變化。

4.1.3糖尿病潰瘍的已經開展的中西醫治療

糖尿病潰瘍的創面修復在以往的清創、清除感染、物理方法如減壓以及中醫藥治療等基礎上，近年有大量新技術的應用。其中典型的新技術是干細胞治療，理論依據是利用于細胞有利于創面修復的自我分化、更新、繁殖能力，干細胞因其在血液循環豐富部位的特殊作用有利于創面修復。還能不斷促進有利于組織修復的細胞增殖。因其在創面組織中可以分泌轉化生長因子-β、表皮細胞生長因子、血管內皮生長因子等對于創面的修復有中藥促進作用。同樣干細胞治療技術目前也還存在一些缺陷。其機制不明確，且安全性還未得到足夠完善的驗證。

中醫藥在近些對于糖尿病潰瘍也通過豐富的治療手段，取得了不錯的療效。膏藥外敷治方面，陳娜使用回陽生肌膏外敷患處治療慢性皮膚潰瘍患者，治療總有效率達到85.0%。濕性外敷治療，苑海剛等用蓬子菜水溶液噴灑于糖尿病潰瘍患者的下肢皮膚潰瘍處，取得了不錯的效果。足浴療法治療，指運用溫熱藥物侵泡足、腿，使身體毛細血管得到擴張來促進足部吸收藥物，加速創面愈合合。吳之平等用自擬方湯劑對糖尿病潰瘍患者進行足浴，得到了顯著的療效。熏洗療法，一種通過中醫整體理論，利用煎煮藥物后所形成的富含藥物成分的蒸汽來熏蒸患者達到治療目的方法。

中藥石香膏正是通過大量臨床使用，得到良好效果的中醫藥治療方法之一。

4.2關于實驗觀察指標

晚期糖基化終末產物即AGEs在糖尿病的整體過程中有著重要的影響，已是糖尿病確診的重要敏感標志物，近年相關的作用機制的研究以及相關的干預藥物的研究已經廣泛的開展，成為熱點之一。有研究表明，AGES具有不可逆性，其機制主要是在機體的高血糖狀態下，體內蛋白質等生物大分子在非酶條件下與葡萄糖或其他還原單糖反應所生成的穩定的糖基化終末產物。糖基化終末產物增多可破壞神經細胞，使其變性甚至壞死以至降低神經傳導速。AGEs除了是糖尿病之外，還是諸多慢性疾病如阿茲海默病、腫瘤的主要致病機制。而目前與糖尿病潰瘍較為緊密的研究，指向了糖尿病患者晚期因糖基化終末產物水平升高，阻礙了內皮細胞和白細胞的相互作用，干擾了細胞因子的分泌，減少內皮細胞增殖從而誘導其調亡，并且降低堿性成纖維細胞生長因子促有絲分裂的活性，降低成纖維細胞合成膠原的能力。

由表1可知7天的樣本，與正常對照組對比，陽性對照組含量明顯上調，說明AGEs確實較多存在于陽性對照組的創面，而貝復濟組含量明顯上調與石香膏組的AGEs的含量明顯下調說明在兩者和正常組對比，石香膏更能明顯降低AGEs含量。與陽性對照組比較，各給藥組AGEs的表達下調，說明石香膏與貝復濟藥物的應用均能對AGEs增多起到抑制作用;而與石香膏組比較，貝復濟組的AGEs表達上調，說明在抑制AGEs方面石香膏對比貝復濟有著更好的效果。14天時間點的樣本的對比，正常對照組的AGEs含量明顯低于其他組，說明與正常創面對比，糖尿病潰瘍狀態下AGEs會增多。而糖尿病潰瘍三組的對比關系與7天時無差異。整體的對比說明了石香膏在治療糖尿病潰瘍抑制AGEs方面起到了明顯的作用。

血管內皮生長因子即VEGF，VEGF是作為促血管生成因子目前發現唯一能對于血管內皮細胞起到特異性作用的，其具體作用包括直接增加血管通透性，并且刺激血管內皮細胞的分裂與增殖;促進血管形成。創面的血管新生為創面肉芽組織形成提供了必要的氧氣以及營養物質，保證了整個修復的良好持續。在慢性難愈合創面中很大可能的重要病理機制就是血管新生受限。相關研究也一直在廣泛開展。通過多種路徑激活VGEF的作用，從而促進血管新生，是近年在創面修復中研究較多的課題。由表2可知，在7天與14天時間點的樣本與正常對照組對比，陽性對照組含量下調表示糖尿病潰瘍創面相較正常創面VEGF明顯較少，修復能力變差。貝復濟組、石香膏組與正常對照組以及陽性對照組相比VEGF的含量明顯上調表示使用兩組藥物有促進VGEF因子增多的效果。而與石香膏組比較，貝復濟組的VEGF表達下調表示石香膏有著更強的促進VGEF增多作用，在糖尿病潰瘍創面的治療上有著更好的效果。

CD-34是高度糖基化I型跨膜糖蛋白，作為黏蛋白樣血管遞質素的一種，可以根據檢測創面CD34表達作為新生血管形成的標記。其相對分子質量為110000，其強陽性表達在血管內皮細胞以及造血干細胞和骨髓基質細胞，其均對血管生成有重要作用。同時，還作為血管內皮細胞的表面特異性標志物，對于創面愈合中有著重要意義，因此檢測CD34的含量可用于反映肉芽組織中新生血管情況，直接影響到創面的愈合。根據國外研究顯示，CD34+造血干細胞對于缺血組織及器官功能有著極大的改善作用。如表3，在7天與14天時間點的樣本與正常對照組對比，陽性對照組含量下調表示在糖尿病潰瘍狀態下CD34會減少，意味著新生血管減少，不利于創面恢復。貝復濟組、石香膏組與正常組及陽性對照組比較CD34的明顯上調意味著兩種藥物都會CD34有促進的作用，可理解為更有利于創面組織的新生血管。與石香膏組比較，貝復濟組的CD34表達下調說明石香膏更能促進CD34增多，表示了窗口新生血管較多，可理解在創面愈合方面有著更好的作用。

本次試驗觀察到石香膏對對于糖尿病潰瘍的治療能夠明顯抑制AGEs，并促進VEGF、CD34表達上調;根據實驗得出相關結果，以及近年廣泛的理論研究，其治療糖尿病潰瘍可以更好的促進創面愈合。