廣西巴馬小型豬miR-148b慢病毒制備及靶基因通路預測分析

張名媛 郭曉萍 孫晴超 司景磊 蘭干球 郭亞芬 蔣欽楊

摘要：【目的】構建廣西巴馬小型豬miR-148b慢病毒表達載體并對其靶基因進行預測及相關通路分析，為揭示miR-148b的作用機制打下基礎。【方法】以廣西巴馬小型豬血液基因組DNA為模板，擴增miR-148b的前體及部分側翼序列，使用T4連接酶將目的片段連接至pLV-CMV-MCS-EF1載體上，構建獲得pLV-miR-148b慢病毒表達載體;以pLV-miR-148b慢病毒表達載體轉染293T細胞48 h后進行表達驗證;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大數據庫預測分析廣西巴馬小型豬miR-148b的靶基因，并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相關通路。【結果】廣西巴馬小型豬miR-148b片段大小為385 bp，與miRBase 21.0網站上已發布豬miR-148b成熟序列（前體和側翼序列）的同源性達100%。構建獲得的pLV-miR-148b慢病毒表達載體能在293T細胞中成功表達，且相對表達量極顯著高于pLV-GFP慢病毒空載質粒轉染組（P<0.01）。數據庫預測分析得到18個廣西巴馬小型豬miR-148b的靶基因，分別為CLOCK（時間晝夜調控因子）、MIER1（轉錄調控因子）、MECP2（甲基化CpG結合蛋白）、ZNF704（鋅指蛋白）、SPTY2D1（SPT2染色質蛋白）、QKI（RNA結合蛋白）、ZBTB20（鋅指蛋白）、MGAT4A（鈉/磷酸轉運蛋白）、UHMK1（編碼蛋白激酶）、PIK3C2A（磷酸肌醇-3-激酶2α肽）、C6orf62（6號染色體開放閱讀框62抗體）、HECW2（E3泛素蛋白連接酶）、MAP1B（微管相關蛋白）、NHS（NHS肌動蛋白調節因子）、B4GALT6（β-1，4-半乳糖基轉移酶）、ATP2A2（肌漿ATP酶/內質網Ca2+轉運酶）、AP4E1（蛋白復合物接頭分子）和BBX（鋅指蛋白）;且發現有11條靶基因相關通路，其中與疾病相關的通路有脂肪酸合成通路、細胞外基質受體相互作用通路、癌癥的蛋白聚糖通路、神經膠質瘤通路、癌癥的小分子核糖核酸通路、腎細胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路。【結論】廣西巴馬小型豬miR-148b慢病毒表達載體能在293T細胞中成功表達，miR-148b存在18個靶基因和11條相關通路，且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相關疾病通路上發揮作用。

關鍵詞： 廣西巴馬小型豬;miR-148b;慢病毒載體;靶基因;相關通路預測

0 引言

【研究意義】microRNA（miRNA）的發現對藥物研發和基礎生物醫學研究領域產生了巨大影響。miRNA作為一種非編碼RNA，是一類進化保守的單鏈小分子RNA，其長度一般在19～23 nt，調控50%左右的蛋白編碼基因，且被證實與很多疾病有關。miR-148是一種新發現的miRNA，屬于miR-148/152家族，其家族包括miR-148a、miR-148b和miR-152。miR-148/152家族各成員在很多腫瘤疾病中存在差異表達，腫瘤的生長、增殖、凋亡、血管新生及對藥物的敏感性等生物學功能均受其調控影響（王曉雪等，2015）。廣西巴馬小型豬具有體型矮小、遺傳相似性高、與人類相近且遺傳穩定性強等特點，是作為相關疾病模型研究的理想實驗材料（宋少銳等，2014;張廣杰等，2018;黃葉等，2019），因此，制備廣西巴馬小型豬miR-148b慢病毒表達載體，并對其靶基因進行預測及相關通路分析，可為揭示miR-148b的作用機制打下基礎。【前人研究進展】miR-148a、miR-148b和miR-152因具有相同的種子序列（UCAGUGCA）而被歸為同一家族，即miR-148/152家族，具有相近的結構和功能（王曉雪等，2015）。其中，Pre-miRNA 148a定位于基因組7p15.2，屬于基因間miRNA，其長度為68 nt;Pre-miRNA 148b定位于基因組12q13.13，為內含子miRNA，長度為99 nt。在大多數腫瘤細胞中，miR-148a通常呈低表達狀態（Linhart et al.，2007），如在肝癌細胞SMMC-7721的侵襲和遷移過程中，miR-148a對此具有負調控作用（賈筱琴等，2014）。在胃癌組織中，miR-148a/b起到抑癌基因的作用，因啟動子區域的CpG島異常甲基化而失活，導致其在胃癌組織中呈低表達狀態（居峰等，2013）。Chen等（2010）、Ueda等（2010）、Zheng等（2011）研究表明，在體外試驗中上調miR-148a/b表達能顯著抑制胃癌細胞的遷移能力。李國喜等（2013）研究發現，在雞胚發育過程中miR-148a的表達呈時序性，且其表達集中在出殼后的發育過程中，為廣泛性表達，調控著諸多器官組織的生長發育。居峰等（2013）研究證實miR-148a的甲基化狀態與DNA甲基轉移酶I（DNMT1）呈正相關。DNA甲基轉移酶（DNMTs）是導致CpG島異常甲基化的重要因素，目前所知的DNMTs可分為DNMT1和DNMT3兩種，其中，DNMT1與甲基化的形成有關，DNMT3則參與甲基化狀態的維持（Okano et al.，1999;Ooi et al.，2007）。關于miR-148b的研究，發現其與多種癌癥相關，如血液惡性腫瘤（王曉雪等，2015）、肝癌（譚翠和莫春容，2016）、乳腺癌（Chen et al.，2018）、胃癌（Li et al.，2018）和腎癌（Zhang et al.，2018）等。王曉雪等（2017）研究表明，miR-148b在急性髓系白血病患者及細胞系中的表達水平較正常對照顯著降低，主要發揮抑癌基因表達的作用。此外，譚翠和莫春容（2016）研究顯示miR-148b通過靶向調控雙特異性磷酸酶1（DUSP1）影響細胞因子CD206的分泌，進而參與肝癌的發生發展過程。【本研究切入點】目前，國內外研究均表明miR-148/152家族在一些生物的腫瘤性疾病中發揮著抑癌基因作用，或在生物的器官發育過程中起調節作用，但至今鮮見以廣西巴馬小型豬為動物模型研究miR-148b抑制腫瘤發生發展作用機理的相關報道。【擬解決的關鍵問題】以廣西巴馬小型豬為研究對象，構建pLV-miR-148b慢病毒表達載體，驗證miR-148b在293T細胞中的表達情況，并對其靶基因進行預測及相關通路分析，為揭示miR-148b的作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬血液樣品和293T細胞由廣西大學動物遺傳育種實驗室保存提供;pCDH-CMV-MCS-EF1慢病毒載體購自美國SBI公司;血液DNA提取試劑盒、SYBR? Prime ScriptTM miRNA RT-PCR Kit、限制性內切酶、pMD19-T載體和T4連接酶購自日本TaKaRa公司;去內毒素質粒試劑盒和膠回收試劑盒均購自美國OMEGA公司;大腸桿菌Trans5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;LTX轉染試劑、PBS、胎牛血清、DMEM和胰酶購自美國Life公司。

1. 2 引物設計與合成

參照miRBase 21.0網站（http：//www.mirbase.org）已公布的豬miR-148b成熟序列（前體和側翼序列），根據miRNA引物設計原則，利用Oligo 7.0設計引物（miR-148b-F：5'-GAATTCTCCTTTGCAGTAG GCTCGTT-3'和miR-148b-R：5'-GGATCCCAATGG ACTAGGCTTGACCTT-3'），同時設計miRNA定量特異性引物5'-GTCAGTGCATCACAGAACTTTGT AA-3'。所有引物委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 3 miR-148b克隆

使用血液DNA提取試劑盒提取廣西巴馬小型豬血液DNA，以血液DNA為模板擴增miR-148b（前體和部分側翼序列）。PCR反應體系20.0 μL：2×Ex Taq PCR Master Mix 10.0 μL，DNA模板3.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，Free water（自由水）補足至20.0 μL。擴增程序：94.0 ℃預變性2 min;94.0 ℃ 15 s，62.4 ℃ 15 s，72.0 ℃ 30 s，進行30個循環;72.0 ℃延伸5 min。擴增產物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠回收純化后連接至pMD19-T載體，再轉化Trans5α感受態細胞，擴增菌液并進行PCR鑒定，提取質粒進行酶切鑒定。將陽性菌液分別送至生工生物工程（上海）股份有限公司和深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1. 4 pLV-miR-148b慢病毒表達載體構建及鑒定

將pLV-CMV-MCS-EF1空載質粒和pMD19-miR- 148b陽性菌質粒進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切線性化處理，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收純化片段，用T4連接酶將miR-148b連接至pLV-CMV-MCS-EF1載體上，然后轉化Trans5α感受態細胞，挑取單個陽性菌落擴菌培養并進行鑒定，重組質粒命名為pLV-miR-148b。采用雙酶切鑒定和菌液PCR驗證重組質粒是否能成功表達，同時送至深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1. 5 miR-148b在293T細胞中過表達驗證

第1 d（細胞轉染前24 h）將復蘇293T細胞以每孔1×105個/mL的密度培養于6孔細胞培養板中;第2 d待293T細胞匯合度達60%～80%時，用LTX轉染試劑將pLV-GFP慢病毒空載質粒和pLV-miR-148b慢病毒重組質粒分別轉染293T細胞，于轉染后48 h觀察293T細胞的綠色熒光表達情況，并拍照和記錄。

1. 6 實時熒光定量PCR（qPCR）鑒定

收集上述陽性細胞，提取細胞RNA，根據mi-RNA反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA，再以稀釋后的cDNA為模板進行qPCR驗證。反應體系如下：2×SYBR? Premix Ex TaqTM 10.0 μL，ddH2O 4.2 μL，miR-486上游引物0.4 μL，通用下游引物0.4 μL，cDNA模板5.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環，擴增讀取熒光信號;95 ℃ 1 s，65 ℃ 1 min，讀取熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算miR-148b的相對表達量。

1. 7 miR-148b靶基因預測

利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大數據庫分析miR-148b的靶向基因，并整合提交至Bioinformatics & Evolutionary Genomics分析網站，預測miR-148b靶基因。

1. 8 miR-148靶基因相關通路分析

使用DIANA Tools中的MirPath v.3分析miR-148b靶基因相關通路，分析通路間的差異以獲得更可靠的miR-148b疾病相關通路，再進行Show Heatmap分析以獲得通路間熱圖。

2 結果與分析

2. 1 廣西巴馬小型豬miR-148b擴增結果

以廣西巴馬小型豬血液DNA為模板，成功擴增出miR-148b的前體及部分側翼序列，電泳條帶清晰，目的片段大小約400 bp（圖1），與預期結果一致。miR-148b的菌液PCR鑒定結果也顯示，擴增獲得的目的條帶清晰且大小正確（圖2），可用于后續研究。生工生物工程（上海）股份有限公司和深圳華大基因科技有限公司的測序結果均表明成功擴增獲得廣西巴馬小型豬miR-148b，其片段大小為385 bp。

2. 2 pLV-miR-148b慢病毒表達載體驗證結果

構建的pLV-miR-148b慢病毒表達載體經雙酶切鑒定，獲得兩條清晰且大小位置均正確的目的條帶，其中廣西巴馬小型豬miR-148b的片段大小為385 bp（圖3），說明pLV-miR-148b慢病毒表達載體構建成功。將pLV-miR-148b慢病毒表達載體的測序結果提交至miRBase 21.0網站進行序列比對分析，結果（圖4）發現廣西巴馬小型豬miR-148b與miRBase 21.0網站上已發布豬miR-148b成熟序列（前體和側翼序列）的同源性達100%。

2. 3 pLV-miR-148b慢病毒表達載體在293T細胞中的表達情況

以pLV-miR-148b慢病毒表達載體和pLV-GFP慢病毒空載質粒分別轉染293T細胞48 h后，熒光顯微鏡下均能觀察到293T細胞中有綠色熒光表達，而陰性對照組未觀察到綠色熒光（圖5）。說明構建的pLV-miR-148b慢病毒表達載體能在293T細胞中成功表達。同時利用qPCR檢測293T細胞中miR-148b的表達情況，結果（圖6）顯示，pLV-miR-148b慢病毒表達載體轉染組的相對表達量極顯著高于pLV-GFP慢病毒空載質粒轉染組（P<0.01）。

2. 4 廣西巴馬小型豬miR-148b靶基因預測結果

利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大數據庫分析廣西巴馬小型豬micRNA-148b的靶向基因，結果（圖7和圖8）表明，從miRDB數據庫獲得miR-148b-3p的靶向基因840個，miR-148b-5p的靶向基因499個;從miRWalk 2.0數據庫獲得miR-148b-3p的靶向基因7502個，miR-148b-5p的靶向基因7911個;從TargetScan 7.2數據庫獲得miR-148b-3p的靶向基因802個，miR-148b-5p的靶向基因4109個。

將預測結果提交至Bioinformatics & Evolutiona-ry Genomics分析網站得到Venn圖，再根據Venn圖得到miR-148b-3p并集的330個靶基因和miR-148b-5p并集的266個靶基因，查找廣西巴馬小型豬miR-148b的靶基因，結果發現存在18個共有靶基因（圖9），分別為CLOCK（時間晝夜調控因子）、MIER1（轉錄調控因子）、MECP2（甲基化CpG結合蛋白）、ZNF704（鋅指蛋白）、SPTY2D1（SPT2染色質蛋白）、QKI（RNA結合蛋白）、ZBTB20（鋅指蛋白）、MGAT4A（鈉/磷酸轉運蛋白）、UHMK1（編碼蛋白激酶）、PIK3C2A（磷酸肌醇-3-激酶2α肽）、C6orf62（6號染色體開放閱讀框62抗體）、HECW2（E3泛素蛋白連接酶）、MAP1B（微管相關蛋白）、NHS（NHS肌動蛋白調節因子）、B4GALT6（β-1，4-半乳糖基轉移酶）、ATP2A2（肌漿ATP酶/內質網Ca2+轉運酶）、AP4E1（蛋白復合物接頭分子）和BBX（鋅指蛋白）。

2. 5 廣西巴馬小型豬miR-148b靶基因相關通路分析結果

采用DIANA Tools中的MirPath v.3對18個廣西巴馬小型豬miR-148b靶基因進行相關通路分析，結果發現有11條相關通路（圖10），其中與疾病相關的通路有脂肪酸合成通路（Fatty acid biosynthesis）、細胞外基質受體相互作用通路（ECM-receptor interaction）、癌癥的蛋白聚糖通路（Proteoglycans in cancer）、神經膠質瘤通路（Glioma）、癌癥的小分子核糖核酸通路（microRNAs in cancer）、腎細胞癌通路（Renal cell carcinoma）、N-聚糖生物合成通路（N-Glycan biosynthesis）和致心律失常性右室心肌病通路（Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy）。將P進行對數換算，分析通路間差異以獲得更可靠的miR-148b相關通路，同時進行Show Heatmap分析以獲得通路間熱圖（圖11），結果發現，miR-148b-3p在脂肪酸合成相關疾病中有重要意義，而miR-148b-5p可能在N-聚糖生物合成和致心律失常性右室心肌病等相關疾病通路上發揮作用。

3 討論

miRNA是一種非編碼RNA，其作用機制是通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式，在轉錄后水平負調控其靶基因表達（王宏浩等，2018）。目前，大多數miRNA是通過反向遺傳學發現，如lin-4、let-7及其他通過經典遺傳學發現的miRNA等，但其功能研究尚處于初級階段，作用靶點和相關分子調控機制也尚未明確。這類miRNA通過基因突變或在miRNA的靶位點上引入突變而抑制miRNA的作用，因此可觀察細胞或活體動物中表達出的性狀變化來推測miRNA功能的相關信息（Cannell et al.，2008），也可通過過表達miRNA推測其相關功能。本研究通過構建廣西巴馬小型豬miR-148b的慢病毒表達載體，轉染293T細胞進行相關表達驗證，并預測miR-148b靶基因及可能的疾病相關通路，為后續的功能研究及miRNA腫瘤治療藥物開發等提供理論指導。

miR-148/152家族成員在許多惡性腫瘤性疾病中存在異常表達，且主要集中在消化系統、循環系統和生殖系統等，普遍發現miR-148表達量呈顯著下降趨勢，即發揮一定的抑癌基因作用。此外，miR-148/152家族成員在一定程度上與疾病的臨床分期和預后相關，對細胞凋亡及腫瘤細胞對化療藥物的敏感性也密切關聯（Wang et al.，2016）。賈筱琴等（2014）研究發現，在體外試驗中肝癌細胞SMMC-7721的侵襲和遷移受miR-148a抑制，進一步證實miR-148a可能是通過調節SMMC-7721肝癌細胞中vimentin、MMP-2和MMP-9的表達以降低MMP-2和MMP-9的活性，從而改變腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。趙錦成等（2016）研究表明， miR-148a在鼻咽癌中也起到對鼻咽癌細胞增殖的抑制作用，可能是通過靶向調控EGFR機制參與鼻咽癌細胞的發生發展。Zhang等（2018）研究發現，腎癌中miR-148b-3p的表達量很低，推測其具有促進腎癌細胞凋亡及抑制細胞增殖和遷移的作用。在現有的研究主要集中在miR-148a，針對miR-148b的研究則相對較少，也說明miR-148b具有更多亟待發掘的內容。本研究通過數據庫預測分析得知，廣西巴馬小型豬miR-148b存在18個靶基因，結合MirPath v.3的相關通路分析，發現有11條靶基因相關通路，其中與疾病相關的通路有脂肪酸合成通路、細胞外基質受體相互作用通路、癌癥的蛋白聚糖通路、神經膠質瘤通路、癌癥的小分子核糖核酸通路、腎細胞癌通路、N-聚糖生物合成和致心律失常性右室心肌病等，為下一步研究miR-148b疾病相關機制提供了依據。雖然關于miR-148/152家族的深入研究正在逐步展開，但具體的調控作用機制及在醫藥方面的實際應用等問題仍然亟待解決，包括新發現miRNA在各種復雜器官系統病理變化過程中的作用靶點及其分子調控網絡機制等，均需進一步探究。

4 結論

廣西巴馬小型豬miR-148b慢病毒表達載體能在293T細胞中成功表達，miR-148b存在18個靶基因和11條相關通路，且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相關疾病通路上發揮作用，可為腫瘤診斷治療及相關miRNA腫瘤治療藥物的研發提供理論依據。

參考文獻：

黃葉，吳延軍，朱思燃，奉玲麗，瞿秋紅，江雨航，夏琴，崔悅悅，莫家遠，蘭干球. 2019. 廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體構建及其相關生物信息學分析[J]. 南方農業學報，50（3）：468-476. [Huang Y，Wu Y J，Zhu S R，Feng L L，Qu Q H，Jiang Y H，Xia Q，Cui Y Y，Mo J Y，Lan G Q. 2019. Construction of eukaryotic expression vector of CTGF gene in Guangxi Bama miniature pig and related bioinformatics analysis[J]. Journal of Southern Agriculture，50（3）：468-476.]

賈筱琴，繆俊俊，雍軍，張子蘭，花晨，李國利. 2014. miR-148a對肝癌細胞株侵襲和遷移的抑制作用及機制[J]. 中國癌癥雜志，24（6）：412-417. [Jia X Q，Miao J J，Yong J，Zhang Z L，Hua C，Li G L. 2014. Inhibition of the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells by miR-148a and the mechanisms[J]. China Oncology，24（6）：412-417]

居峰，左君波，朱阿考，晏江，夏加增，張熔熔，萬佳藝. 2013. 胃癌組織中miR-148a基因甲基化狀態與DNA甲基轉移酶1的關系[J]. 中華實用診斷與治療雜志，27（4）：361-363. [Ju F，Zuo J B，Zhu A K，Yan J，Xia J Z，Zhang R R，Wan J Y. 2013. Association between the methylation status of miR-148a gene and DNA methyltransferase 1 in gastric cancer tissues[J]. Journal of Chinese Practical Dia-gnosis and Therapy，27（4）：361-363.]

李國喜，閆峰賓，王樂樂，賈麗娟，孫桂榮，康相濤. 2013. 雞miR-148a的組織表達及其發育調控功能預測分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報，29（10）：962-968. [Li G X，Yan F B，Wang L L，Jia L J，Sun G R，Kang X T. 2013. Tissue expression profile and putative development regulatory function of miR-148a in chickens[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，29（10）：962-968.]

宋少銳，吳延軍，蔣世強，張名媛，郭亞芬，蘭干球，蔣欽楊， 2014. 廣西巴馬小型豬MCP-1基因克隆及序列分析[J]. 南方農業學報，45（9）：1669-1673. [Song S R，Wu Y J，Jiang S Q，Zhang M Y，Guo Y F，Lan G Q，Jiang Q Y. 2014. Cloning and analysis of MCP-1 gene in Guangxi Bama mini-pig[J]. Journal of Southern Agriculture，45（9）：1669-1673.]

譚翠，莫春容. 2016. miR-148b/DUSP1調節巨噬細胞分泌細胞因子CD206促進肝癌的發生[J]. 第三軍醫大學學報，38（3）：270-275. [Tan C，Mo C R. 2016. miR-148b/DUSP1 mediates macrophage CD206 secretion to induce hepatocarcinoma cell growth[J]. Journal of Third Military Medical University，38（3）：270-275.]

王宏浩，韓文靜，張燕軍，蘇蕊，劉志紅，王瑞軍，王志英，趙艷紅，王志新，李金泉. 2018. circRNA研究現狀及展望[J].南方農業學報，49（3）：431-439. [Wang H H，Han W J，Zhang Y J，Su R，Liu Z H，Wang R J，Wang Z Y，Zhao Y H，Wang Z X，Li J Q. 2018. Research in circRNA：A review[J]. Journal of Southern Agriculture，49（3）：431-439.]

王曉雪，富威，梁穎，李艷. 2017. miR-148b在急性髓系白血病患者及細胞系中的表達與生物學功能[J]. 現代腫瘤醫學，25（3）：340-344. [Wang X X，Fu W，Liang Y，Li Y. 2017. Preliminary study on expression and biological functions of miR-148b in acute myeloid leukemia patients and cell lines[J]. Journal of Modern Oncology，25（3）：340-344.]

王曉雪，王玥，王萍萍，李艷. 2015. microRNA-148/152家族在血液惡性腫瘤中的表達[J]. 中國實驗血液學雜志，23（4）：1173-1178. [Wang X X，Wang Y，Wang P P，Li Y. 2015. Expression of microRNA-148/152 family in hematologic malignancies[J]. Journal of Experimental Hematology，23（4）：1173-1178.]

張廣杰，崔悅悅，邱慶慶，夏琴，李龍，司景磊，夏攀杰，鄒輝，蘭干球. 2018. 廣西巴馬小型豬SP1基因克隆測序及其真核表達載體的構建[J]. 南方農業學報，49（2）：360-366. [Zhang G J，Cui Y Y，Qiu Q Q，Xia Q，Li L，Si J L，Xia P J，Zou H，Lan G Q. 2018. Clone sequencing of gene SP1 in Guangxi Bama mini pig and construction of its eukaryotic expression vector[J]. Journal of Southern Agriculture，49（2）：360-366.]

趙錦成，石穎，王宇，張穎，馬新，賈占紅，吳再軍，張京秋. 2016. miR-148a在鼻咽癌中的表達及其對腫瘤細胞生物學功能的影響[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，30（15）：1219-1223. [Zhao J C，Shi Y，Wang Y，Zhang Y，Ma X，Jia Z H，Wu Z J，Zhang J Q. 2016. The expre-ssion of miR-148a in nasopharyngeal carcinoma and its effect on tumor cell biology functions in nasopharyngeal carcinoma[J]. Journal of Clinical Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，30（15）：1219-1223.]

Cannell I G，Kong Y W，Bushell M. 2008. How do micro-RNAs regulate gene expression？[J]. Biochemical Socie-ty Transactions，36（6）：1224-11231.

Chen X，Wang Y W，Gao P. 2018. SPIN1，negatively regula-ted by miR-148/152，enhances Adriamycin resistance via upregulating drug metabolizing enzymes and transporter in breast cancer[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，37：100. doi：10.1186/s13046-018-0748-9.

Chen Y，Song Y X，Wang Z N，Yue Z Y，Xu H M，Xing C Z，Liu Z K. 2010. Altered expression of miR-148a and miR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance[J]. Journal of Gastrointestinal Surgery，14（7）：1170-1179.

Li X W，Jiang M Z，Chen D，Xu B，Wang R，Chu Y，Wang W J，Zhou L，Lei Z J，Nie Y Z，Fan D M，Shang Y L，Wu K C，Liang J. 2018. miR-148b-3p inhibits gastric cancer metastasis by inhibiting the Dock6/Rac1/Cdc42 axis[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，37：71. doi：10.1186/s13046-018-0729-z.

Linhart H G，Lin H，Yamada Y，Moran E，Steine E J，Gokhale S，Lo G，Cantu E，Ehrich M，He T，Meissner A，Jaenisch R. 2007. Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novo methylation and transcriptional silencing[J]. Genes & Development，21（23）：3110-3122.

Okano M，Bell D W，Haber D A，Li E. 1999. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development[J]. Cell，99（3）：247-257.

Ooi S K T，Qiu C，Bernstein E，Li K Q，Jia D，Yang Z，Erdjument-Bromage H，Tempst P，Lin S P，Allis C D，Cheng X D，Bestor T H. 2007. DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA[J]. Nature，448（7154）：714-717.

Ueda T，Volinia S，Okumura H，Shimizu M，Taccioli C，Rossi S，Alder H，Liu C G，Oue N，Yasui W，Yoshida K，Sasaki H，Nomura S，Seto Y，Kaminishi M，Calin G A，Croce C M. 2010. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncology，11（2）：136-146.

Wang R F，Ye F，Zhen Q，Song T Y，Tan G L，Chu W W，Zhang Y X，Lv B L，Zhao X J，Liu J B. 2016. micro-RNA-148b is a potential prognostic biomarker and predictor of response to radiotherapy in non-small-cell lung cancer[J]. Journal of Physiology and Biochemistry，72（2）：337-343.

Zhang H，Ye Q，Du Z F，Huang M，Zhang M，Tan H F. 2018. MiR-148b-3p inhibits renal carcinoma cell growth and pro-angiogenic phenotype of endothelial cell potentially by modulating FGF2[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，107：359-367.

Zheng B，Liang L，Wang C，Huang S，Cao X，Zha R，Liu L，Jia D，Tian Q，Wu J，Ye Y，Wang Q，Long Z，Zhou Y，Du C，He X，Shi Y. 2011. microRNA-148a suppresses tumor cell invasion and metastasis by downregulating ROCK1 in gastric cancer[J]. Clinical Cancer Research，17（24）：7574-7583.

（責任編輯 蘭宗寶）