甲基尿石素A對油酸誘導的Huh—7細胞脂質累積的改善作用及其機制研究

張聰 周俊旋 盛　磊 馬俊俏 李　歆 鄭國華 劉思丹 邱振鵬

甲基尿石素A對油酸誘導的Huh-7細胞脂質累積的改善作用及其機制研究Δ

張 聰*，周俊旋，盛 磊，馬俊俏，李 歆，鄭國華，劉思丹，邱振鵬 #（湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065）

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）06-0741-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.06.05

摘 要 目的：研究甲基尿石素A對油酸誘導的人肝癌Huh-7細胞脂質累積的改善作用及機制。方法：采用油酸誘導建立細胞脂質累積模型。取Huh-7細胞，分為對照組（培養基）和模型組（1 mmol/L油酸）、低劑量藥物組（1 mmol/L油酸+10 μmol/L甲基尿石素A）和高劑量藥物組（1 mmol/L油酸+20 μmol/L甲基尿石素A），采用油紅O染色法觀察細胞中脂質累積情況；采用三酰甘油（TG）酶法測定細胞內TG含量，采用聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測細胞中脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調節元件結合蛋白1（SREBP-1）、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPAR-α）、PPAR-γ的mRNA表達水平；采用Western blotting法檢測細胞中FASN的蛋白表達水平。結果：采用油酸誘導后，細胞膜周圍出現大量脂滴累積；細胞內脂質及TG含量均顯著升高，FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達水平及FASN的蛋白表達水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）。采用甲基尿石素A干預后，細胞膜周圍的脂滴明顯減少；細胞中脂質及TG含量均顯著降低，FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達水平及FASN的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：甲基尿石素A對油酸誘導的Huh-7細胞脂肪累積有一定的改善作用，其機制可能與下調FASN、SREBP-1、PPAR-γ等相關因子的表達，抑制脂肪酸從頭合成、促進脂質代謝有關。

關鍵詞 甲基尿石素A；油酸；人肝癌Huh-7細胞；脂質累積；機制

Study on Improvement Effect of Methylated Urolithin A on Oleic Acid-induced Lipid Accumulation in Huh-7 Cells and Its Mechanism

ZHANG Cong，ZHOU Junxuan，SHENG Lei，MA Junqiao，LI Xin，ZHENG Guohua，LIU Sidan，QIU Zhengpeng （College of Pharmacy， Hubei University of TCM， Wuhan 430065， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect and mechanism of methylated urolithin A on oleic acid-induced lipid accumulation in human liver cancer Huh-7 cells. METHODS： Oleic acid was adopted to induce lipid accumulation model cells. Huh-7 cells were divided into control group （culture medium）， model group （1 mmol/L oleic acid）， low-dose group （1 mmol/L oleic acid+10 μmol/L methylated urolithin A） and high-dose group （1 mmol/L oleic acid+20 μmol/L methylated urolithin A）. Oil red O staining was used to observe lipid accumulation in cells. Triglyceride（TG） enzyme assay was applied to determine the TG content in cells. PCR was employed to detect the mRNA expression of FASN， SREBP-1， PPAR-α and PPAR-γ in cells. Western blotting was used to determine the protein expression of FASN in cells. RESULTS： After induced by oleic acid， a large amount of lipid droplet accumulated around the cells； the intracellular lipid and TG content， mRNA expression levels of FASN， SREBP-1 and PPAR-γ， protein expression levels of FASN were increased significantly， while mRNA expression level of PPAR-α was decreased significantly （P<0.01）. After intervened with methylated urolithin A， lipid droplet around the cells decreased significantly； the contents of lipid and TG in cells were decreased significantly， while the mRNA expression levels of FASN， SREBP-1 and PPARγ and protein expression level of FASN were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Methylated urolithin A can improve oleic acid-induced lipid accumulation in Huh-7 cells， the mechanism of which may be associated with inhibiting fat synthesis， promoting lipid metabolism and down-regulating the expression of metabolism-related factors as FASN， SREBP-1 and PPAR-γ.

KEYWORDS Methylated urolithin A； Oleic acid； Human liver cancer Huh-7 cells； Lipid accumulation； Mechanism

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種常見慢性肝臟疾病[1]，其病理特征主要為肝細胞內脂質大量堆積，其中以三酰甘油（TG）的累積為主[2]，可進一步發展至肝硬化、肝細胞癌等[3]。“雙重打擊學說”作為NAFLD的發病機制已被廣泛認可，即脂質在肝臟細胞質內的聚集（即“第一次打擊”）觸發了一系列的細胞毒性事件（即“第二次打擊”），從而導致肝損傷[4]。因此，抑制肝細胞內脂質堆積成為了預防和治療NAFLD的重要途經。

尿石素類（Urolithins）化合物是存在于石榴等水果及其他堅果中的鞣花單寧經體內腸道菌群作用后代謝而成的一類具有不同酚羥基的二苯并喃-6-酮衍生物，其具有抗癌、降脂、抗炎、抗氧化等作用[5]。Kang I等[6]研究發現，尿石素 A、B、D均可減少脂肪肝細胞中TG的累積。但尿石素類化合物分子結構中含有多個酚羥基，易被氧化[7]，故其化學性質不穩定、生物利用度較低，限制了其廣泛應用。甲基尿石素A是尿石素A結構上第8位的羥基中氫原子被甲基取代后的產物，其與尿石素A、B等具有相似的藥理學作用，且因甲基取代使其化學性質比尿石素A更為穩定，故其生物利用度得以提高；此外，甲基尿石素A相較于尿石素A等更易合成、成本更低，因此更具開發應用價值[8-9]。Qiu Z等[10]研究表明，甲基尿石素A與尿石素A、B具有相似的抗炎、抗增殖作用。但目前關于甲基尿石素A改善脂質累積方面的作用尚未見研究報道。基于此，本課題組采用油酸誘導人肝癌Huh-7細胞建立脂質累積模型，考察甲基尿石素A對脂質累積的改善作用并探討其分子機制，為該化合物的進一步開發應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2培養箱（日本Sanyo公司）；xMark型酶標儀、Trans-Blot? TurboTM全能型蛋白轉膜系統、Power Pac Basic型電泳儀、TC20型細胞計數器、CFX96型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；XB 220A型分析天平（瑞士Precisa公司）。

1.2 藥品與試劑

甲基尿石素A原料藥[武漢大學人民醫院藥學部周本宏教授合成惠贈，純度（高效液相色譜法）：>97%]；油酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：O108484]；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所，批號：CK04）；組織細胞TG酶法測定試劑盒（北京普利萊技術有限公司，批號：E1013）；BCA 蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學發光液、M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑、InvitrogenTM TRIzolTM RNA提取試劑、InvitrogenTM SuperScriptTM Ⅳ逆轉錄酶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（北京康為世紀生物科技有限公司）；脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調節元件結合蛋白1（SREBP-1）、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPAR-α）、PPAR-γ、β-actin的上下游引物（美國Invitrogen公司）；兔FASN單克隆抗體、兔β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號分別為C20G5、4970、7074）；熒光定量PCR試劑（上海星漢生物科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京索萊寶科技有限公司）；DMEM高糖培養基、PBS（pH 7.4）、0.25%胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（美國EpiZyme Scientific公司）；油紅O染液（武漢谷歌生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

人肝癌Huh-7細胞購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 細胞培養

Huh-7細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基（以下簡稱“培養基”），在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養（以下培養條件相同）。取對數生長期細胞，先經胰蛋白酶消化后，再進行后續試驗。

2.2 藥物溶液配制

2.2.1 油酸溶液 吸取油酸10 μL，加入0.1 mol/L NaOH溶液305 μL，于70 ℃水浴中加熱30 min，制成100 mmol/L的油酸母液；以10%BSA溶液稀釋制成10 mmol/L的油酸溶液，以0.22 μm濾膜濾過即得，于-20 ℃條件下保存，備用。

2.2.2 甲基尿石素A溶液 稱取甲基尿石素A原料藥48.2 mg，以二甲基亞砜1 mL溶解制成200 mmol/L的母液，于-20 ℃條件下保存，備用。臨用時以培養基稀釋制成20 mmol/L的溶液，以0.22 μm濾膜濾過后使用 。

2.3 造模/給藥濃度篩選

2.3.1 油酸造模濃度篩選 （1）取對數生長期Huh-7細胞，以5×104個/孔的密度接種于12孔培養板，每孔1 mL，培養24 h后，分為對照組和不同濃度油酸組。其中，對照組加入培養基，其余組分別加入含油酸終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的培養基，培養24 h。取細胞用PBS清洗3次，75%乙醇固定20 min，在避光條件下以油紅O染液染色30 min[11]，PBS清洗后在顯微鏡下觀察細胞內脂質累積情況；然后每孔加入60%異丙醇0.5 mL，室溫放置15 min以充分溶解細胞上附著的染液[12]；采用酶標儀于485 nm波長處測定各孔吸光度（A），A值越大則表明脂質含量越高。（2）取對數生長期Huh-7細胞，以8×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后，分為對照組和不同濃度藥物組（加樣量同“（1）”項下），培養24 h。另設不含細胞、只加入培養基的空白組。每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續培養2 h后，采用酶標儀于450 nm波長處測定各孔A值，并計算細胞存活率[細胞存活率=（A給藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%]。每組設置4個復孔，試驗重復3次。

2.3.2 甲基尿石素A給藥濃度篩選 按“2.3.1（2）”項下方法接種細胞、培養，分為對照組和不同濃度甲基尿石素A組，并另設空白組。其中，空白組、對照組同法處理，其余組分別加入含甲基尿石素A終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L的培養基，培養24 h。按“2.3.1（2）”項下方法，自“每孔加入CCK-8 試劑10 μL……”起同法操作，測定并計算細胞存活率。每組設置4個復孔，試驗重復3次。

2.4 甲基尿石素A對細胞中脂質累積的影響考察

取對數生長期Huh-7細胞，以8×104個/孔的密度接種于12孔培養板，每孔1 mL，培養24 h后，分為對照組、模型組（劑量根據“2.3.1”項結果確定）、低劑量藥物組（劑量根據“2.3.2”項結果確定）和高劑量藥物組（劑量根據“2.3.2”項結果確定）。其中，對照組加入培養基，其余組分別加入含相應終濃度油酸或油酸+甲基尿石素A的培養基，培養24 h。然后按“2.3.1（1）”項下方法，自“取細胞用PBS清洗3次，75%酒精固定20 min……”起同法操作，進行油紅O染色，觀察細胞內脂質累積情況并測定各孔A值。每組設置3個復孔，試驗重復3次。

2.5 甲基尿石素A對細胞中TG含量的影響考察

取對數生長期Huh-7細胞，以5×106個/皿的密度接種于細胞培養皿，每皿5 mL，培養24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥及培養。按照TG酶法測定試劑盒說明書步驟，測定細胞中TG含量。每組設置3個復孔，試驗重復3次。

2.6 甲基尿石素A對細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達的影響考察

采用PCR法檢測。取對數生長期Huh-7細胞，以2×106個/孔的密度接種于6孔培養板，每孔2 mL，培養24 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥及培養。采用TRIZol試劑抽提細胞RNA，并采用逆轉錄酶逆轉錄成cDNA后檢測FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達水平。PCR反應體系（10 μL）組成：cDNA 0.5 μL，上下游引物1.0 μL，2×Taq PCR Mix 5.0 μL，雙蒸水3.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環（引物序列見表1）。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法[13]計算相關基因的mRNA表達水平（Ct表示每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數）。每組設置3個復孔，試驗重復3次。

表1 引物序列

Tab 1 Primer sequence

[基因名稱＼&引物序列 ＼&序列長度，bp＼&β-actin＼&正向：5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′＼&190＼&＼&反向：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′＼&＼&FASN＼&正向：5′-TGGTCTTTCTGTGCTTGGATT-3′＼& 80＼&＼&反向：5′-GGAGTCTTGGCAGGGTGGA-3′＼&＼&SREBP-1＼&正向：5′-GGCACGGGAGGATGGACT-3′＼&130＼&＼&反向：5′-GCTTCTTTGCTGTGAGATGACC-3′＼&＼&PPAR-α＼&正向：5′-CCCAGTGGAGCATTGAACAT-3′＼&223＼&＼&反向：5′-GTGACATCCCGACAGAAAGG-3′＼&＼&PPAR-γ＼&正向：5′-CTCTCCGTAATGGAAGACCAC-3′＼&184＼&＼&反向：5′-CAGGCTCCACTTTGATTGCAC-3′＼&＼&]

2.7 甲基尿石素A對細胞中FASN的蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法檢測。取對數生長期Huh-7細胞，按“2.5”項下方法接種、分組、給藥及培養。用胰蛋白酶消化并收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的哺乳動物蛋白抽提試劑（三者體積比為 1 ∶ 1 ∶ 98），冰上裂解30 min；在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋10倍，采用BCA法進行蛋白定量。加入蛋白上樣緩沖溶液，混勻，于95 ℃變性5 min，-20 ℃保存，待測。取變性后的蛋白樣品40 μg進行SDS- PAGE電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；分別加入FASN、β-actin一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃培養過夜，然后以TBST緩沖液清洗10 min×3次；加入二抗（1 ∶ 8 000），室溫孵育1 h，以TBST緩沖液清洗10 min×3次；加入ECL化學發光液顯影。采用凝膠成像儀檢測，以Image J 1.8.0軟件進行分析，以β-actin為內參計算相對灰度值，用來表示目標蛋白的表達水平。每組設置3個復孔，試驗重復3次。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用t檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 油酸和甲基尿石素A的造模/給藥濃度

油紅O染色結果顯示，1.0～2.5 mmol/L的油酸均能使細胞中形成大量脂滴累積；當油酸濃度≥2.0 mmol/L時，細胞形態萎縮、數量減少。細胞存活率檢測結果顯示，隨著油酸或甲基尿石素A作用濃度的升高，細胞存活率隨之下降；當油酸≤1.0 mmol/L時，細胞存活率>80%；當甲基尿石素A濃度≤20 μmol/L時，細胞存活率>80%。因此，選擇1.0 mmol/L為油酸的造模濃度，10、20 μmol/L為甲基尿石素A的給藥濃度，在這一濃度條件下，兩者對細胞均無明顯毒性。不同濃度油酸作用下各組細胞脂質累積情況顯微圖見圖1，不同濃度油酸或甲基尿石素A作用下各組細胞存活率見圖2。

3.2 甲基尿石素A對細胞中脂肪累積的影響

與對照組比較，模型組細胞鏡下可見有明顯的脂肪累積現象，細胞膜周圍有大量紅色脂滴；A值檢測結果顯示，細胞中脂質含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細胞鏡下可見紅色脂滴明顯減少；A值檢測結果顯示，細胞中脂質含量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。各組細胞脂質累積情況顯微圖見圖3，脂質含量檢測結果見圖4。

3.3 甲基尿石素A對細胞中TG含量的影響

與對照組比較，模型組細胞中TG含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細胞中TG含量均顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中TG含量測定結果見圖5。

3.4 甲基尿石素A對細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）；而PPAR-α的mRNA表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。各組細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達水平檢測結果見圖6。

3.5 甲基尿石素A對細胞中FASN蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞中FASN的蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，低、高劑量藥物組細胞中FASN蛋白的表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組細胞FASN的蛋白電泳圖見圖7，蛋白表達水平檢測結果見圖8。

4 討論

NAFLD的典型特征是肝細胞內脂質積聚，而TG作為積聚脂質的主要成分，其累積主要是由其合成與轉化之間的不平衡引起的[14]。研究表明，機體脂肪酸過量累積能促進脂肪細胞分化及脂質合成相關轉錄因子的生成，使大量脂肪堆積，從而引起肥胖[15]。脂肪酸的大量積聚會對肝細胞造成慢性損傷，這一過程與NAFLD的慢性肝脂肪變性相似[14]。油酸是人體內天然存在的一種脂肪酸，以其為誘導劑建立脂質累積模型的方法已被廣泛應用，具有成本低、耗時短、可較好地模擬NAFLD狀態下肝細胞損傷的優點[16]。肝癌細胞具有易于培養、穩定等特點[17]，是目前研究NAFLD常用的細胞模型。因此，本研究以人肝癌Huh-7細胞為對象，采用油酸誘導建立體外脂質累積細胞模型。

FASN是脂肪合成的關鍵酶，可催化乙酰輔酶 A 和丙二酰輔酶A從頭合成長鏈軟脂酸棕櫚酸酯的所有步驟，其編碼基因的表達直接影響脂肪酸的合成，對調控機體脂肪酸累積具有重要意義[18]。Kim KH等[19]研究證實，抑制FASN的表達能抑制肝脂質累積，改善肝脂肪變。SREBP-1是調節肝脂質代謝的關鍵轉錄因子，PPARs對肝細胞內脂質合成、運輸和儲存具有重要的調節作用[20]。FASN、SREBP-1、PPAR-α和PPAR-γ均為調節脂肪酸從頭合成和TG合成的關鍵因子，PPAR-γ的表達增強能促進前脂肪細胞向脂肪細胞分化[21]；SREBP-1的表達增強能激活FASN的表達；FASN的表達增強，能促進脂質合成，顯著增加脂質在體內沉積[22]。PPAR-α是線粒體脂肪酸β氧化過程中的關鍵酶，能使脂肪酸從線粒體內膜轉運到線粒體基質中被代謝[16]。由此可見，FASN、SREBP-1、PPAR-γ對機體脂質累積具有正向調節作用，而PPAR-α對脂質累積具有負向調節作用。本研究結果顯示，油酸誘導后，細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表達水平及FASN的蛋白表達水平均顯著升高，PPAR-α的mRNA表達水平顯著降低，提示肝細胞中脂質累積可能是由于脂肪酸的從頭合成增強，從而激活脂質攝取和抑制脂質分解而引起的。采用甲基尿石素A干預后，能明顯抑制油酸誘導的細胞中脂質累積，降低細胞中TG含量；細胞中FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA和FASN的蛋白表達水平均顯著降低，而PPAR-α的mRNA表達水平無顯著變化。由此推測，甲基尿石素A可能主要通過抑制脂肪酸從頭合成途徑來抑制脂質累積，而并未激活脂肪酸β氧化途徑，故對PPAR-α 的mRNA表達無顯著影響。

綜上所述，甲基尿石素A可能通過下調FASN、SREBP-1、PPAR-γ等相關因子的表達，抑制脂肪酸從頭合成、促進脂質代謝，從而降低細胞內TG含量、改善油酸誘導的細胞中脂質累積狀態，在NAFLD的防治領域具有一定的藥用潛力。

參考文獻

[ 1 ] 李春苗，羅雁，張硯，等.非酒精性脂肪性肝病發生和進展的綜合影響因素[J].醫學綜述，2017，23（17）：3401- 3405.

[ 2 ] 張旸，辛永寧，宣世英.非酒精性脂肪性肝病的研究進展[J].中國藥物經濟學，2015，10（S2）：262-263.

[ 3 ] MACHADO MV，CORTEZ-PINTO H. Non-alcoholic fatty liver disease：what the clinician needs to know[J]. World J Gastroenterol，2014，20（36）：12956-12980.

[ 4 ] 董姝，劉平，孫明瑜.非酒精性脂肪肝發病機制：“二次打擊”學說研究進展[J].臨床肝膽病雜志，2012，28（7）：551-555.

[ 5 ] TOMáS-BARBERáN FA，GONZáLEZ-SARRíAS A，GARCIA-VILLALBA R，et al. Urolithins，the rescue of “old” metabolites to understand a “new” concept：metabotypes as a nexus among phenolic metabolism，microbiota dysbiosis，and host health status[J]. Mol Nutr Food Res，2017. DOI：10.1002/mnfr.201500901.

[ 6 ] KANG I，KIM Y，TOMAS-BARBERAN FA，et al. Urolithin A，C，and D，but not iso-urolithin A and urolithin B，attenuate triglyceride accumulation in human cultures of adipocytes and hepatocytes[J]. Mol Nutr Food Res，2016，60（5）：1129-1138.

[ 7 ] MENA P，DALL’ASTA M，CALANI L，et al. Gastrointestinal stability of urolithins：an in vitro approach[J]. Eur J Nutr，2017，56（1）：99-106.

[ 8 ] ZHOU B，WANG J，ZHENG G，et al. Methylated urolithin A，the modified ellagitannin-derived metabolite，suppresses cell viability of DU145 human prostate cancer cells via targeting miR-21[J]. Food Chem Toxicol，2016.DOI：10.1016/j.fct.2016.10.005.

[ 9 ] 邱振鵬.WNT7B在肝細胞癌中的作用及urolithins抗腫瘤機制研究[D].武漢：武漢大學，2014.

[10] QIU Z，ZHOU B，JIN L，et al. In vitro antioxidant and antiproliferative effects of ellagic acid and its colonic metabolite，urolithins，on human bladder cancer T24 cells[J]. Food Chem Toxicol，2013. DOI：10.1016/j.fct.2013.06.025.

[11] 秦紅霞，趙玲，王宇豪，等.兩種脂肪細胞內脂滴染色方法的比較研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2014，23（6）：544-547.

[12] 李甜，廖茂梁，鄭雅楠，等.澤瀉湯對油酸誘導HepG2細胞脂肪堆積的抑制作用[J].現代藥物與臨床，2017，32（5）：772-775.

[13] CHEN GH，LUO Z，HOGSTRAND C，et al. SREBP1，PPARG and AMPK pathways mediated the Cu-induced change in intestinal lipogenesis and lipid transport of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco[J]. Food Chem，2018. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.07.048.

[14] HWANG YJ，WI HR，KIM HR，et al. Pinus densiflora Sieb. et Zucc. alleviates lipogenesis and oxidative stress during oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells[J]. Nutrients，2014，6（7）：2956-2972.

[15] ?á?EK P，BUKOWSKI M，MEHUS A，et al. Dietary saturated fatty acid type impacts obesity-induced metabolic dysfunction and plasma lipidomic signatures in mice[J]. J Nutr Biochem，2018. DOI：10.1016/j.jnutbio.2018.10.005.

[16] 張靖偉，姚英俊，梁媛，等.油酸對C57/BL6J小鼠脂肪干細胞體外成脂分化的影響[J].大連工業大學學報，2017，36（5）：333-337.

[17] LI J，ZHU L，ZHANG YM，et al. Sheng-jiang powder ameliorates high fat diet induced nonalcoholic fatty liver disease via inhibiting activation of Akt/mTOR/S6 pathway in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2018. DOI：10.1155/2018/6190254.

[18] LI L，PILO GM，LI X，et al. Inactivation of fatty acid synthase impairs hepatocarcinogenesis driven by AKT in mice and humans[J]. J Hepatol，2016，64（2）：333-341.

[19] KIM KH，HONG SP，KIM K，et al. HCV core protein induces hepatic lipid accumulation by activating SREBP1 and PPARgamma[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，355（4）：883-888.

[20] 楊谷良，潘敏雄，向福，等.PPARγ調控脂肪細胞增殖和分化機理研究進展[J].食品科學，2017，38（3）：254-260.

[21] CHOI WI，JEON BN，PARK H，et al. Proto-oncogene FBI-1（pokemon）and SREBP-1 synergistically activate transcription of fatty-acid synthase gene（FASN）[J]. J Biol Chem，2008，283（43）：29341-29354.

[22] EHARA T，KAMEI Y，YUAN X，et al. Ligand-activated PPARalpha-dependent DNA demethylation regulates the fatty acid beta-oxidation genes in the postnatal liver[J]. Dia- betes，2015，64（3）：775-784.

（收稿日期：2018-09-07 修回日期：2019-01-25）

（編輯：段思怡）