4—羥基苯并噁唑—2—酮對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的改善作用及機制研究

黃秀昆 孫雪梅 朱勛帥 劉林 林興 林軍

中圖分類號 R575；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）06-0747-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.06.06

摘 要 目的：觀察4-羥基苯并噁唑-2-酮（HBOA）對四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化的改善作用及其機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.4 mg/kg）和HBOA低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組12只。除正常對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水外，其余各組大鼠均灌胃50%CCl4-橄欖油溶液（2 mL/kg，首劑量加倍），每周2次，連續12周，復制肝纖維化模型。自造模第9周起，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物，正常對照組和模型組大鼠均灌胃等體積0.6%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續4周。末次給藥后，檢測各組大鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-10的含量以及肝組織中核因子κB p65（NF-κB p65）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6、細胞間黏附因子1（ICAM-1）蛋白的表達水平。結果：與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中NF-κB p65陽性表達明顯增多，且其血清ALT、AST、IL-1β含量以及肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表達水平均顯著升高，血清IL-10含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中NF-κB p65陽性表達均有不同程度的減弱，且其血清ALT、AST、IL-1β含量以及肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表達水平均顯著降低，血清IL-10含量均顯著升高（P<0.05）。結論：HBOA對CCl4致大鼠肝纖維化具有一定的改善作用，其作用機制可能與其阻斷NF-κB信號通路繼而減輕炎癥反應以及下調ICAM-1蛋白的表達有關。

關鍵詞 4-羥基苯并噁唑-2-酮；肝纖維化；核因子κB信號通路；炎癥因子；細胞間黏附因子；大鼠

Study on Improvement Effect and Mechanism of 4-hydroxy-2-benzoxazolone on Carbon Tetrachloride- induced Hepatic Fibrosis in Rats

HUANG Xiukun，SUN Xuemei，ZHU Xunshuai，LIU Lin，LIN Xing，LIN Jun（College of Pharmacy， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the improvement effect and mechanism of 4-hydroxy-2-benzoxazolone （HBOA） on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， colchicine group （positive control， 0.4 mg/kg） and HBOA low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 75， 100 mg/kg）， with 12 rats in each group. Except for normal control group was given constant volume of normal saline intragastrically， other groups were given 50%CCl4-olive oil solution （2 mL/kg， initial dose double） intragastrically， twice a week， for consecutive 12 weeks， to induce hepatic fibrosis model. Since the 9th week of modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically. Normal control group and model group were given constant volume of 0.6% Carboxymethylcellulose sodium solution intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After last administration， the serum contents of ALT， AST， IL-1β and IL-10， the protein expression of NF-κB p65， TNF-α， IL-6 and ICAM-1 in liver tissue were determined. RESULTS： Compared with normal control group， the positive expression of NF-κB p65 in liver tissue was increased significantly in model group； serum contents of ALT， AST and IL-1β as well as protein expression of NF-κB p65， TNF-α， IL-6 and ICAM-1 in liver tissure were increased significantly， while serum content of IL-10 was decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the positive expression of NF-κB p65 in liver tissue were decreased to different extents in administration groups； serum contents of ALT， AST and IL-1β as well as protein expression of NF-κB p65， TNF-α， IL-6 and ICAM-1 in liver tissue were decreased significantly， while serum content of IL-10 was increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： HBOA can improve carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats， and the mechanism of which may be associated with relieving inflammatory reaction by blocking NF-κB signaling pathway and down-regulating the protein expression of ICAM-1.

KEYWORDS 4-hydroxy-2-benzoxazolone； Hepatic fibrosis； NF-κB signaling pathway； Inflammatory factors； ICAM； Rats

肝纖維化是一種動態的雙向進程，具有恢復和重塑的內在能力，其主要機制與肝細胞的重復損傷、炎癥反應的激活以及肝星狀細胞的活化、增殖有關[1]。其中，肝細胞損傷和炎癥反應可刺激肝星狀細胞分泌大量細胞外基質（ECM），導致膠原沉積，進一步激化肝纖維化進程[1]；同時當受到持續性損傷時，肝會產生一系列慢性炎癥反應促進肝纖維化的形成，并促使肝纖維化最終進展為肝硬化[2]。近年來，肝硬化的病死率逐年增高，已成為全球患者發病和死亡的主要原因之一[3]。因此，探索減輕肝損傷、抑制慢性炎癥反應的方法對進一步闡明肝纖維化的機制具有非常重要的臨床意義。

老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）是一種重要的藥用紅樹林植物，我國民間主要用以治療急慢性肝炎、淋巴結腫脹、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘等癥[4]。本課題組前期研究發現，老鼠簕的藥理活性成分主要為老鼠簕生物堿，具有顯著的抗炎、鎮痛和保肝作用[5]。4-羥基苯并噁唑-2-酮（4-hydroxy-2-benzoxazolone，以下簡稱“HBOA”）是老鼠簕生物堿中的活性單體之一。為了進一步明確該化合物對肝的保護作用，本研究擬建立四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝纖維化模型，探討其抗肝纖維化的可能機制，以期為其后續深入研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

7100型全自動血生化分析儀（日本Hitachi公司）；BX53型正置顯微鏡（日本Olympus公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；SpectraMaxPlus384型連續光譜掃描式酶標儀（香港分子儀器有限公司）；Odyssey型雙色紅外熒光掃描成像系統（美國Licor公司）；SWB-20L-1型恒溫搖床、MP-300V型電泳儀（美國Major Science公司）。

1.2 藥品與試劑

HBOA原料藥（由廣西醫科大學藥學院藥物化學教研室合成，純度：99.4%）；秋水仙堿片（陽性對照，云南植物藥業有限公司，批號：20160901，規格：0.5 mg）；羧甲基纖維素鈉、CCl4均購自西隴化工股份有限公司；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為C009-3、C010-3）；白細胞介素1β（IL-1β）、IL-10酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為CK-E30418R、CK-E30651R）；兔GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司，批號：ab181602）；山羊抗兔IgG二抗（美國LI-COR Biosciences公司，批號：P/N926-32211）；兔細胞核因子κB p65（NF-κB p65）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：8242s）；兔抗大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體、兔IL-6多克隆抗體、兔細胞間黏附因子1（ICAM-1）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為PB0082、A00102-2、BA2189）；通用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）檢測試劑盒（含正常山羊血清封閉液、生物素標記的山羊抗兔IgG二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈酶素卵白素工作液，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：SP-9000）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號分別為P0015、P0013B、P0010S）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：T1082）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Merck Millipore公司，批號：ISEQ00010）；蘇木精、伊紅染液以及二氨基聯苯胺溶液均由廣西醫科大學實驗中心免疫組化實驗室配制；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠77只，5周齡，體質量為（180±20）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供[動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003]。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

所有大鼠均在標準環境下適應性飼養1周，其中12只大鼠設為正常對照組，灌胃等體積生理鹽水；其余65大鼠均灌胃50%CCl4-橄欖油溶液（2 mL/kg，首劑量加倍），每周2次，連續12周以復制肝纖維化模型[6]。造模第8周，隨機選取5只造模大鼠的肝組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，行病理學檢查，若大鼠肝細胞水腫明顯、脂肪變性廣泛，肝竇和匯管區可見炎癥細胞浸潤和纖維組織增生等病理改變，則表明模型復制成功。將其余60只大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組（0.4 mg/kg，劑量設置參考本課題組前期研究結果[7]；以水為溶劑）以及HBOA低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg，劑量設置參考本課題組前期研究成果[7]；以0.6%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，并于臨用前配制），每組12只。自造模第9周開始，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物，正常對照組和模型組大鼠均灌胃等體積0.6%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續4周。

2.2 標本的采集及處理

末次給藥后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，于腹主動脈取血，以35 000 r/min離心15 min后，分離血清。取血后處死大鼠，取肝適量，用生理鹽水清洗干凈。上述樣品均置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 大鼠血清中ALT、AST、IL-1β、IL-10含量的檢測

采用速率法以全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中ALT、AST含量，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-10含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.4 大鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表達的檢測

采用免疫組化法檢測大鼠肝組織中NF-κB p65蛋白的表達情況，參照SP檢測試劑盒及相應抗體說明書操作：將大鼠肝組織切片（厚度約為4～5 μm），經常規脫蠟、水化后，行高壓抗原熱修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，甩除多余液體，滴加NF-κB p65單克隆抗體（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，下同）清洗3次，每次5 min；滴加相應生物素標記的山羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 10 000），滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液適量，室溫孵育30 min，以PBS清洗3次，每次5 min，用二氨基聯苯胺溶液顯色，用水清洗，經蘇木精復染、脫水、透明、干燥后，以中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察（棕黃色區域為NF-κB p65表達陽性），每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），采用Image Pro-plus 6.0軟件分析并計算其平均光密度，以表示NF-κB p65蛋白的表達量。

采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白的表達。使用RIPA裂解液提取大鼠肝組織蛋白后，采用BCA法檢測其蛋白含量并調節蛋白濃度，按體積比4 ∶ 1的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于95 ℃變性8 min，取變性后的蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE電泳，并于電泳后以濕轉法轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應一抗[TNF-α（1 ∶ 500）、IL-6（1 ∶ 400）、ICAM-1（1 ∶ 200）、GAPDH（1 ∶ 10 000）]，4 ℃孵育過夜，以TBST溶液清洗3次，每次5 min；加入相應二抗（均為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h后，取出，以TBST溶液清洗3次，每次5 min，置于熒光掃描成像系統上成像，采用Image Pro-plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

2.5 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 HBOA對CCl4致肝纖維化大鼠血清ALT、AST、IL-1β、IL-10含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、IL-1β含量均顯著升高，IL-10含量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALT、AST、IL-1β含量均顯著降低，IL-10含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見表1。

3.2 HBOA對CCl4致肝纖維化大鼠肝組織NF-κB p65蛋白表達的影響

正常對照組大鼠肝組織中NF-κB p65蛋白呈極弱陽性表達，僅有少量分布于肝竇周圍、肝細胞及匯管區血管壁，且顯色較淺。與正常對照組比較，模型組大鼠肝小葉、肝竇周圍、肝細胞、血管壁等均可見深著色陽性表達區，匯管區、纖維間隔區亦可見片狀融合，且其NF-κB p65蛋白表達量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織著色區縮小、顯色變淺，且其NF-κB p65蛋白表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見圖1、表2。

3.3 HBOA對CCl4致肝纖維化大鼠肝組織TNF-α、IL-6、ICAM-1表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白的相對表達量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白的相對表達量均顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見圖2、表2。

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷向肝硬化發展的中間階段，也是肝應對損傷的自我修復過程，其病理過程是在各種致病因子的刺激下，肝星狀細胞被激活并大量分泌ECM，使得ECM的合成與降解失衡，導致其在肝內過度沉積，從而引發肝損傷[8]。本課題組前期研究表明，老鼠簕鎮痛、抗炎及保肝作用的主要活性物質為老鼠簕生物堿，其中活性單體HBOA具有一定的保肝活性，但確切的作用機制尚不清楚[9-10]。有研究表明，秋水仙堿對大鼠肝纖維化具有明顯的改善作用，可作為相關研究的陽性對照藥物[11]。因此，本研究以秋水仙堿為陽性對照，通過CCl4誘導復制大鼠肝纖維化模型，初步探討了老鼠簕活性單體HBOA對大鼠肝纖維化的改善作用及其可能機制。

對肝細胞受損程度進行評價的常用指標包括ALT、AST等。在致病因子的作用下，肝細胞會促使其內部的ALT和AST釋放入血，引起血清轉氨酶含量的升高，且不同肝臟疾病所致ALT、AST升高的程度也有所差異，故對其進行定量分析可有助于肝疾病的診斷以及病情嚴重程度的評估[12-14]。蔣征奎等[15]研究表明，降低由CCl4致肝纖維化大鼠血清中ALT、AST等的含量可有助于緩解其肝損傷。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST含量均顯著升高，差異均有統計學意義，提示大鼠肝臟受到了損傷。經HBOA干預后，大鼠血清ALT、AST含量均較模型組顯著下降，差異均有統計學意義。這提示HBOA可改善CCl4引起的肝損傷，對肝臟具有一定的保護作用。

IL-1β是一種促炎因子，可促進肝星狀細胞的激活，從而進一步促進肝纖維化的形成[16]；IL-10是一種抗炎因子，通過調控炎癥反應來緩解肝損傷[17]；IL-6由活化的肝星狀細胞分泌，可反饋性地刺激肝星狀細胞的增殖，使后者處于持續活化的狀態，故IL-6是肝星狀細胞活化的重要標志之一[18]。同時，IL-6和TNF-α是炎癥反應的重要介質，當肝組織存在活動性炎癥時，肝細胞可持續分泌TNF-α、IL-6，從而加重肝細胞的炎癥反應，進一步加重肝損傷[19-20]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β以及肝組織TNF-α、IL-6含量均顯著升高，血清IL-10含量顯著降低，差異均有統計學意義；經HBOA干預后，各給藥組大鼠血清IL-1β以及肝組織TNF-α、IL-6含量均顯著降低，血清IL-10含量均顯著升高，差異均有統計學意義。這提示HBOA可通過抑制促炎因子、上調抗炎因子的表達來減輕大鼠的炎癥反應，降低其肝損傷程度。

NF-κB由p65、p50兩個亞單位構成的異源二聚體，在調節免疫應答和炎癥反應中具有重要作用[21]。在肝纖維化的發展過程中，肝星狀細胞中NF-κB信號通路持續活化，并伴有NF-κB p65蛋白表達的持續增強，進而進一步加劇了各種炎癥因子的浸潤、膠原合成及ECM分泌的增加[22-23]。NF-κB信號通路可被TNF-α、IL-1β等因子誘導激活，因此可通過抑制IL-1β、TNF-α的分泌、下調NF-κB p65蛋白的表達等途徑來改善肝纖維化癥狀[24-26]。本研究結果表明，正常對照組大鼠肝組織中NF-κB p65的表達量極少；模型組大鼠肝組織中NF-κB p65的表達則明顯增高；經HBOA干預后，大鼠肝組織中NF-κB p65的表達受到了明顯抑制。這提示HBOA可能通過抑制NF-κB信號通路來發揮其抗肝纖維化的作用。

ICAM-1是反映機體免疫活性和炎癥反應嚴重程度的主要指標之一：當炎癥發生時，ICAM-1的表達將會增強，且與肝細胞炎癥嚴重程度呈正相關[27]。有研究認為，肝組織中ICAM-1表達水平與肝組織炎癥損傷程度密切相關，其可能是抗纖維化的作用靶點之一[28-30]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中ICAM-1蛋白的相對表達量顯著升高，差異有統計學意義；經HBOA干預后，各給藥組大鼠肝組織中ICAM-1蛋白的相對表達量均顯著下降，差異均有統計學意義。這提示HBOA可通過下調ICAM-1蛋白的表達來降低肝纖維化的程度。

綜上所述，HBOA對CCl4致大鼠肝纖維化具有一定的改善作用，其作用機制可能與其阻斷NF-κB信號通路繼而減輕炎癥反應以及下調ICAM-1蛋白的表達有關。但肝纖維化發病機制復雜，其具體作用機制還有待進一步挖掘。

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（收稿日期：2018-06-11 修回日期：2018-12-29）

（編輯：張元媛）