試論食品微生物檢測中LAMP方法的有效運用

韋玲雙 陸麗婷

【摘 ?要】食品微生物與我們的生活的息息相關，近來年我們對于食品微生物的利用、檢測和防治也越來越重視。LAMP也稱環介導等溫擴增技術，是近年來新興微生物檢測技術，該技術較其他檢測技術相比具有更高的靈敏性，并且能夠節約時間和成本、操作和結果判定相對簡單等優點，因此能夠快速應用于食物中的細菌、霉菌、病毒等微生物的檢測。本文通過對LAMP技術在細菌、病毒、寄生蟲、支原體等病菌中的檢測進行分析，以期為食品高質量快速檢測提供參考。

【關鍵詞】LAMP方法;食品微生物;檢測;食品安全

一、前言

食品微生物伴隨這人類的產生，對我們的生活有利有弊，但食源性致病菌以及實物變質產生的病菌不斷的威脅著人們的健康，甚至不斷威脅著我們的生命。隨著分子生物學的不斷發展，各種微生物檢測方法不斷被研究，而快速、高效、低成本的檢測方法也越來越得到人們的重視，其中環介導等溫擴增技術作為新型的核酸擴增技術以其獨特的優點和特異性被廣泛應用于食品快速檢測和現場檢測中，為我們進行快速的食品檢測提供了可靠依據。

二、LAMP技術原理及檢測方法發展

LAMP技術是由Notomi等人于2000年提出的一種高效的鏈取代核酸技術，其特殊的靈敏性和特異性立即被應用于各種診斷而備受矚目。

1.LAMP基本原理

LAMP是針對靶序列的6個區域設計4條特殊的引物，然后利用Bst DNA聚合酶在恒溫條件下保溫進行核酸擴增反應，擴增后觀察副產物焦癖酸鎊的沉淀情況。LAMP不僅僅可以對DNA和RNA都可以擴增，所有的操作過程只需要用到水浴鍋既可。

2.LAMP的終點檢測方法

① 我們根據可以LAMP在將DNA擴增后產生的焦磷酸根離子能與鎂離子生成白色的沉淀這一的特性來判斷LAMP反應是否發生;

② 通過向在擴增產物中加入熒光染料后顏色的變化來辨別;

③ 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察分離后行成的梯形狀條帶來確定。

三、LAMP在臨床微生物檢測中應用及進展

①對沙門氏菌的檢測

沙門氏菌是一種常見的病原菌，多見于禽肉類食品當中，往往可以引起人們的食物中毒。自使用LAMP法對沙門氏菌檢測以來，大大節約了檢測該病菌的時間和成本，將以往檢測的時間由2-3天縮短到一個小時內。且傳統的檢測方法對儀器的要求嚴格，而LAMP法則針對沙氏門菌中的STN、fimY或者?invA設計引物，然后通過瓊脂糖凝膠電泳法分離，最后通過肉眼就能觀察出結果，以此來檢測食品中沙門氏菌的存在。曾有人利用該方法檢測出?7 種不同的沙門氏菌，可見該方法在食品檢測方面的靈活性與特異性。

②對中阪崎腸桿菌的檢測

阪崎腸桿菌多見于嬰兒食品中，為革蘭氏陰性菌常可致使嬰兒患敗血癥、腦膜炎、菌血癥等疾病，因此對于阪崎腸桿菌的檢測相當重要。我們根據阪崎腸桿菌的16S-23S rRNA或者OmpA作為靶序列設計引物，利用聚合酶緩沖液恒溫擴增并結合熒光染料監測擴增反應的進程，該方法能夠實現對樣品進行實時且直觀的分析，顯示檢測結果的陰陽性，且耗時短，是常規PCR技術的100倍。

③對單增李斯特菌的檢測

單增李斯特菌是一種人畜共患病原菌和食源性病原菌，可引發嘔吐、腹痛甚至骨髓炎、心肌炎等疾病。檢測中我們針對單增李斯特菌的hlyA基因設計引物在Bst DNA聚合酶作用下63℃反應45 min，然后采用瓊脂糖凝膠電泳法進行確定最終的檢測結果。楊愛華等利用DNA提取試劑盒，采用Primer 4.0軟件對單增生性李斯特菌的hlyA基因設計了4條具有特異性的環介導等溫核酸擴增引物，

并對引物濃度、反應溫度和Mg2+濃度優化，在63℃恒溫下反應和80℃加熱后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和顯色反應鑒定出單增李斯特菌最低檢測限為3 CFU/mL。

④對金黃色葡萄球菌的檢測

金黃色葡萄球菌很容易污染食品，甚至能夠導致人們食物中毒，檢測中我們根據金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶序列，然后進行LAMP擴增，最后用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證實驗。張濤濤也利用改良的LAMP技術進行實驗，確定了金黃色葡萄球菌的生長曲線呈對數增長，且基因組DNA的提取方法為改良的SDS法，從而得出LAMP法的最佳溫度為60℃，時間為45 min，并證明出LAMP技術的靈敏度要比PCR高出100倍。

四、總結

食品中微生物檢測是食品安全檢測的重要部分，食品的安全額也是人們健康與否的關鍵，傳統方法的食品微生物檢測的局限性和弊端日漸突出，甚至不能檢測出食品中的有害物質，大大的影響著食品的安全性。LAMP技術作為新型的快速、安全的檢測方法，也在不斷的被改進和研究，目前它不僅能夠實現對單樣品多種不同靶基因的同時檢測，也能夠實現對多種樣品的高通量檢測。

LAMP技術的實施與不斷改進不但在食品微生物方面有突出的表現，在檢測食品過敏原成分和食品動物源成分方面也有重要的應用，從而對尋找和檢測過敏原和肉類食品檢測方面大大提高了檢測的效率，為預防和治療多種疾病提高了時效和安全保證。此外LAMP技術能夠轉基因食品的改良上也有突出的表現，對轉基因食品實現了快速的現場檢測。

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（作者單位：1.廣西中知國華知識產權代理有限公司;2.廣西中知科創知識產權代理有限公司）