獐的消化道微生物探索

王怡然

[關鍵詞]獐;消化道;微生物

腸道微生物，是指動物腸道內全部的、復雜的、動態變化的微生物群落，腸道微生態系統與宿主的營養、代謝和免疫等方面密切相關。動物并不是一個單純的個體，與動物伴生著的，是寄生于動物里的數量龐大的細菌們。它們廣泛分布在我們的口腔、腸道、皮膚、眼角膜、生殖道等幾乎身體的各處。很多時候是多種菌交叉互利共生，組成一個復雜的體系，往大了說，組成的是一個生態系統，而且專門適應于某種特定動物的腸道。因此，研究物種消化道微生物是了解這一關系的重要起點。

1919年，科學家發現了埃希氏細菌，這一發現標志著人們對消化道微生物奧秘探索的開始。從此，人們開始大量研究消化道微生物，這些研究主要集中在探究消化道菌群與宿主之間的關系。從而研究了消化道微生物的組成結構、群落多樣性和一些生理特性問題（Smriga et al，2010）。隨著研究技術的發展，特別是分子生物學的快速發展，消化道微生物的研究也迅猛發展。近年來，對消化道微生物的研究主要集中在家禽家畜、實驗動物、野生動物、昆蟲和人中，從高等白蟻消化道中分離到的多種異養型細菌，大多數為兼性厭氧菌（陳虹，2005），有的甚至是嚴格好氧菌，包括鏈球菌（Streptococcus sp.）、擬桿菌（Bacteroids sp.）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、葡萄球菌（StaphylOCOCCl，8sp）和芽胞桿菌（Bacilus sp）（黃云，2009）。Bairagi等人（Bairagi，2002）的相關研究表明，常見的草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鯉魚（Cypnnus carpio）、羅非魚（Oreochromis mossambica）等9種魚類的消化道中，一些好氧細菌同時也具有分泌消化酶的功能，分泌的消化酶種類主要有淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等。當人們知道了消化道微生物對生物體的健康與疾病的關系之后，很多微生物制劑被應用到健康領域、醫學領域、環境保護、分子生物領域等。消化道微生物的研究會越來越多，為我們揭示更多與寄主的關系，更多的造福人類。

消化道微生物參與動物體的生長、發育、消化、吸收、營養、免疫、生物拮抗及其它各個方面的功能和結構的發生、發展和衰退的全過程（Ley et al.，2008）。其數量龐大，在成人消化道中，大約棲息著500種細菌，數量達到了1012-1014個，是人體自身細胞數量的10倍（Mcfall-Ngaiet al，2013）。

1研究對象

獐，為研究對象。又名河麂、毛獐、牙獐，偶蹄目、鹿科、獐亞科，是國家二級野生重點保護動物，IUCN紅色名錄易危等級。本實驗的目的是：探索獐消化道里微生物的種類。

2實驗方法

通過野外采樣：1.解剖采集消化道樣本，胃、十二指腸、回腸、結腸、盲腸。采集地址：崇明島明珠湖公園、松江浦南林地、浦東華夏公園。2采集糞便樣本（上海動物園）3.DNA提純：用土壤動物DNA提純試劑盒提純DNA。4高通量測序以及數據分析等過程完成實驗。

3統計方法

3.IOTU聚類分析法：對測序結果進行OTU聚類分析。OTU聚類分析：OTU（Operational Taxonomic Units）是為了便于研究人員進行分析，在群體遺傳學或系統發生學科研究中，人為的為某一個分類單元（比如品系，屬，種、分組等）設置的一個同一標志。如果要了解一個樣本測序結果里細菌的種或屬數目信息，就必須對結果所得序列進行歸類操作（cluster）。然后通過歸類操作，再將序列按照樣本彼此的相似性，進行分成各個小組，每個小組即為一個OTU。可根據樣本中序列不同的相似度水平，對所有樣本序列進行OTU歸類劃分，一般是先選擇在97%的OTU相似水平序列，再進行生物信息統計學分析。利用Usearch軟件進行處理。

分析方法具體為：先對優化序列提取序列中的非重復部分，這樣方便降低分析中間過程時的冗余計算量，然后再去除沒有重復的單序列，對非重復序列（不包含單序列），按照97%的相似性，對OTU進行聚類分析，在聚類分析的過程中，注意要去除嵌合體，然后便可得到OTU的代表序列。把所有的優化序列map到OTU代表序列中，然后選出相似性在97%以上的序列為代表序列，進而生成OTU表格。為得到所有OTU對應的物種分類上的信息，采用RDP classifier貝葉斯算法，對OTU代表序列（97%相似水平）進行統計分類分析，并在所有水平進行統計每個樣品的群落構成。

選擇以下幾個數據庫：16s細菌和古菌核糖體數據庫（在沒有特別指定時，可默認使用silva數據庫）（Silva et al，2013）CReleasel23http：//www.arb-silva.de），RDP（Cole et al，2009）（Release 113http：//rdp.cmemsu.edu/）;18S真菌數據庫：Silva（Qnast et al，2013）;ITS真菌數據庫：Unite（Urmaset al，2013）;功能基因：FGR（Jordanetal，2013）;RDP的整理來自于GeneBank的功能基因數據庫。

3.2多樣性指數分析。群落生態學中的研究微生物群落多樣性，通過對每個樣品進行多樣性分析（Alpha多樣性），便可以反映微生物的群落多樣性和物種豐度，還包括應用一系列的統計生物學分析指數來估計環境群落的物種豐度和多樣性。

Shannon指數：可用來估算樣本中微生物群落多樣性，并且可以與Simpson多樣性指數來反映alpha生物多樣性指數。在Shannon值越大時，群落多樣性就越高。使用的軟件：mothur（Schloss et al，2011）。

3.3繪制香農威納（sharmon-Wiener）曲線，所使用軟件：以97%相似度水平的OTU為基礎，使用mothur來計算不同的隨機抽樣下的得到的shannon值，然后利用R語言工具，繪制曲線圖。

Shannon-Wiener指數是用來反映樣品中微生物群落多樣性的一個指標（YuWanget al 2012）。以各樣本的測序量為基礎，構建在不同測序深度時的微生物群落多樣性指數曲線，以此來反映在不同測序數量時，各個樣品的微生物群落多樣性情況。當香農威納曲線趨于平坦時，此時說明測序數據量足夠大，并可以反映已經包含了樣品中的絕大多數的微生物多樣性信息。

3.4繪制稀釋性曲線（Rarefaction curve），所使用軟件是：依然是以97%相似度的OTU為基礎，并做mothur做rarefaction分析，然后通過R語言工具來制作曲線圖。

4實驗結論

獐的消化道和糞便中的微生物，可測出的含量超過1%的微生物一共有約16個門。消化道里有104個屬，糞便里有113個屬。（自然界中食草動物平均140多個屬，食肉動物平均92個屬。

5討論

壁菌門為革蘭氏陽性，是人體及高等哺乳動物腸道內最為優勢的一大類細菌，比例約占總菌群的50-60%（Subnmgrnang et al，2004：Schuurman et al，2007;Zoetendal et al，2001）。厚壁菌門中的部分細菌對多糖的代謝和對于宿主的能量供應及腸上皮細胞的發育有重要作用（Hooper et al，2001）。在未補鹽實驗中成獐的回腸、結腸優勢菌都是厚壁菌門，且胃部第二大優勢菌也是厚壁菌門，它們或許對獐的多糖代謝、能量供應以及細胞的發育起到了一定的作用。

擬桿菌門是人體腸道內第二大優勢類群，數量僅次于厚壁菌門。這一類細菌屬于革蘭陰性的嚴格厭氧菌，具有碳水化合物發酵、參與膽汁酸和類固醇代謝、維持腸道正常生理等諸多功能，對人體健康具有重要影響（schloss et al，2005）。并且其中的部分細菌還能夠降解人體不能代謝的植物多糖，為宿主提供能量（schloss et al，2005）及抵御腸侵人性病原菌的粘附等功能（Dyszynski et al，2006）。無論在未補鹽或補鹽實驗中，我們發現獐消化道和糞便中擬桿菌門含量較高，擬桿菌門可能也會在獐的消化道中對糖代謝、膽汁酸及類固醇的代謝和維持腸道正常生理等方面起到了一定的積極作用。