細胞自噬與多囊卵巢綜合征研究進展

楊碩

〔摘要〕 多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome， PCOS）是導致女性月經不調、排卵障礙性不孕的主要原因，確切發病機制尚未闡明。自噬可以發生在卵泡發育的各個階段，卵泡顆粒細胞自噬相對活躍，具有促性腺激素依賴性和細胞特異性。卵泡顆粒細胞自噬穩態平衡以維持卵巢功能，調控卵泡發育，影響胚胎質量和妊娠結局。PCOS卵泡顆粒細胞自噬活性過高，自噬相關基因表達過強，與PCOS卵泡發育異常、內分泌代謝紊亂、臨床自然流產率高和輔助生殖中發生卵巢過度刺激綜合征風險增高密切相關，可能是PCOS發病的重要機制。補腎中藥通過下調PCOS卵泡顆粒細胞過度自噬，改善卵巢功能，維持機體陰陽平衡，但具體作用機制亟待進一步闡明，為PCOS、不孕癥等婦科疑難病癥臨床診療提供新思路。

〔關鍵詞〕 多囊卵巢綜合征;卵泡顆粒細胞自噬;卵泡發育;補腎中藥

〔中圖分類號〕R271;R711? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.031

Research Advances in Cell Autophagy and Polycystic Ovary Syndrome

YANG Shuo

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Polycystic ovary syndrome （PCOS） is the main cause of irregular menstruation and ovulatory dysfunctional infertility in women， and its pathogenesis remains unclear. Autophagy can occur at all stages of follicular development， and autophagy of follicular granulosa cells is relatively active， which has gonadotropin dependence and cell specificity. Homeostasis of follicular granulosa cell autophagy plays an important role in maintaining ovarian function and regulating follicular development and can affect embryo quality and pregnancy outcome. High activity of follicular granulosa cells and high expression of autophagy-related genes are observed in patients with PCOS and are closely associated with follicular dysplasia， endocrine and metabolic disorders， a high rate of spontaneous abortion in clinical practice， and an increased risk of ovarian hyperstimulation syndrome during assisted reproduction， which may be an important pathogenesis of PCOS. Kidney-tonifying traditional Chinese herbs can improve ovarian function and maintain Yin-Yang balance by downregulating excessive autophagy of follicular granulosa cells， but the specific mechanism needs to be further clarified， in order to provide new ideas for clinical diagnosis and treatment of difficult gynecological diseases such as PCOS and infertility.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome; follicular granulosa cell autophagy; follicular development; kidney-tonifying traditional Chinese medicine

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合癥[1-2]，卵泡發育異常是PCOS的最棘手問題，是導致女性月經不調、排卵障礙性不孕的主要原因，嚴重影響育齡期女性生殖健康。卵泡發育成熟并排卵是非常精密、有序而復雜的過程，有賴卵巢和卵泡微環境自身穩態的維持。自噬是以自噬體出現為特征的一種細胞分解代謝機制。卵泡內顆粒細胞維持自噬穩態平衡，參與并調節卵泡的發育和閉鎖，維持卵巢的正常功能[3-7]。國內外學者對顆粒細胞自噬與PCOS發病機制的研究甚少，但隨著近年來人們對于顆粒細胞自噬與卵巢功能、卵泡發育及其調控機制等相關性的認識和研究，有證據表明顆粒細胞自噬可能是PCOS卵泡發育異常及性激素合成失調的重要影響因子，對于促進PCOS卵泡發育成熟及排卵具有重要意義，并與PCOS患者臨床自然流產發生率增高和輔助生殖中發生卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome， OHSS）風險增高密切相關。

1 細胞自噬概述

自噬是以自噬體出現為特征的一種細胞分解代謝機制。細胞自噬依賴自身溶酶體，形成自噬體，程序性自我消化降解的過程，并為細胞提供能量和合成底物，維持細胞正常功能，是一種重要的生物學現象。當細胞處于饑餓、缺氧等不良環境刺激下，細胞自噬調控啟動，既可以保護受損細胞，進行亞細胞水平上的重構，又可以作為一種Ⅱ型細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡，維持體內環境穩定和能量代謝[8]。自噬不足可能引起機體衰老、疾病;自噬持續活化可能導致細胞凋亡、壞死;過度自噬可能破壞細胞結構，引起細胞死亡。細胞內環境自噬平衡打破與疾病發生密切相關[9]。

參與自噬調控的基因稱為自噬相關基因（autophagy-related gene，Atg），是自噬特異性基因，主要來自對酵母細胞的研究，目前已發現30多個參與細胞自噬調控的基因[10-12]，如微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein light chain3，MAP1-LC3，LC3）和Beclin-1是哺乳動物體與Atg6同源的自噬基因。LC3在大鼠體內有LC3A和LC3B兩種不同剪切，其中LC3B在各組織中分布較為廣泛，以胞質型LC3BⅠ與自噬體膜型LC3BⅡ2種形式存在。胞質型LC3BⅠ與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3BⅡ定位在自噬體膜上，參與自噬體的形成過程，與自噬體的數量有關，通常以LC3BⅡ/LC3BⅠ比值大小評價細胞自噬水平。Beclin-1基因則通過與B細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2， Bcl-2）、Vps34等自噬相關蛋白結合形成多蛋白復合體調控細胞自噬。

2 顆粒細胞自噬調節卵泡發育與閉鎖

人類卵泡自胚胎形成后即進入自主發育和卵泡閉鎖的軌道，進入青春期后，每個月經周期有一批（3～11個）卵泡發育，經過周期募集、選擇，一般最終只有一個優勢卵泡發育成熟并排出卵子，其余卵泡自行退化而閉鎖[1]。人類卵泡的發育、成熟及其排出是非常精密、有序而復雜的過程，受到下丘腦-垂體-卵巢軸和卵巢旁/自分泌活動的調控，有賴卵巢和卵泡微環境自身穩態的維持。

卵泡由卵母細胞、顆粒細胞及卵泡膜細胞組成[13]。卵泡內顆粒細胞位于卵母細胞透明帶的外側，可分為壁顆粒細胞、竇顆粒細胞和卵丘顆粒細胞，其旁分泌甾體激素功能和細胞有絲分裂活性的表型異質。卵丘顆粒細胞與卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合物，隨著竇腔發育、體積增大和顆粒細胞增殖，卵泡快速膨脹并移至卵巢表面，復合物完成生長、成熟，并在排卵時隨著卵泡破裂與卵子一起釋放。殘存的顆粒細胞及卵泡膜細胞則分化為黃體。壁顆粒細胞分泌的C型利鈉肽（C-type natriuretic peptide， CNP）和腦型利鈉肽（brain natriuretic petide， BNP）與卵丘顆粒細胞上的利鈉肽受體2（natriuretic peptide receptor 2， Npr2）結合，卵丘顆粒細胞環鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate， cGMP）增高經細胞縫隙連接下調卵母細胞環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）降解，高濃度cAMP維持卵母細胞減數分裂停滯狀態。排卵前，卵泡刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）與黃體生成素（luteinizing hormone， LH）協調作用于卵泡內顆粒細胞，降低cAMP，卵母細胞恢復減數分裂，完成核成熟、胞質成熟，卵泡破裂并排卵，直到受精，第二極體分離排出，完成第二次減數分裂，提高了卵泡的發育潛能[14]。當次級卵泡形成時，顆粒細胞產生雌激素（estrogen， E）、雄激素（androgen， A）和FSH的3種受體，并通過縫隙連接與鄰近細胞相連，彼此間通過營養物質的交換和分子信號的傳遞調節卵子發生和卵泡發育成熟，影響卵母細胞的質量。

正常情況下，顆粒細胞決定著卵泡的結局，可能通過連接蛋白、激素和卵巢局部細胞因子等共同作用及多條信號通路，卵泡內顆粒細胞維持自噬和凋亡間的平衡，參與并調節卵泡的發育和閉鎖，維持卵巢的正常功能[3-7]。研究發現LC3蛋白主要在卵泡顆粒細胞中表達，表明自噬作用主要發生在顆粒細胞，并具有細胞特異性和區域特異性，且顆粒細胞自噬與凋亡具有很好的相關性和促性腺激素（gonadotropin， Gn）依賴性的特點[11]。閉鎖可以發生在卵泡發育的各個階段。由于顆粒細胞在卵泡閉鎖過程中最先發生自噬，形成自噬體積累并引起凋亡，所以推測顆粒細胞可能通過自噬進一步影響卵泡的發育和閉鎖過程。TGF-β超家族/Smad信號通路在卵泡發育過程中發揮著重要的調控作用[15]。Smad3主要定位于體內竇前卵泡和早竇卵泡的未/低分化顆粒細胞中，在體外培養的顆粒細胞亦表達明顯。研究發現Smad3能增加LC3BⅡ/LC3BⅠ比值，即Smad3過表達使Bcl-2蛋白表達水平明顯增加，從而促進體外培養SD大鼠卵巢顆粒細胞自噬[12]。Gao等[16]研究表明豬顆粒細胞的自噬活性增加能促進顆粒細胞孕激素的分泌，在哺乳動物卵泡發育過程中發揮著重要的調控作用。Gannon等[17]研究發現有毒物質如香煙煙霧，可能通過增加自噬體數量和增強卵泡顆粒細胞中LC3等自噬關鍵基因表達，導致小鼠卵泡數量減少，引起卵泡自噬和凋亡。

顆粒細胞自噬相對活躍，可以發生在卵泡發育的各個階段，參與調節并貫穿卵泡發育、成熟及閉鎖的全過程[18-19]。亦有研究發現：行卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection， ICSI）治療患者的卵丘顆粒細胞自噬水平越低，卵子成熟度越低，受精能力越差，受孕幾率越低，胚胎質量越差[20]。顆粒細胞自噬活性及凋亡狀態，參與調控卵母細胞成熟及受精過程，影響卵子質量、卵子成熟度和受精能力，進而影響胚胎質量和妊娠結局。

3 顆粒細胞自噬與PCOS發病

根據流行病學統計，PCOS約占無排卵性不孕的70%，占育齡期婦女的5.6%，是導致女性月經不調、排卵障礙性不孕的主要原因[21]。其個體臨床表現、生化指標、發病機制具有異質性，確切發病機制尚未闡明。卵泡發育異常是PCOS的最棘手問題，以竇狀卵泡發育阻滯、早期生長卵泡數量增多和優勢卵泡選擇障礙導致的周期性無排卵為主要特征[22]。卵巢多囊樣改變：卵巢增大，包膜增厚呈白色，表面光滑;卵泡發育在竇中期閉鎖，呈車輪狀排列;顆粒細胞層逐漸退化、變薄，功能不良[23]。研究發現：PCOS大鼠顆粒細胞自噬率明顯高于正常大鼠，顆粒細胞減少與自噬率增高具有相關性[24-26]。

自噬的經典調節方式有2種，一種是Beclin-1與Bcl-2、Vps34、Vps15等形成蛋白復合體，調控細胞自噬;另一種是雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑，mTOR是細胞自噬的負調控因子，其抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）通過下調mTOR表達，從而激活細胞自噬。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/mTOR通路與卵泡發育及細胞自噬都密切相關[27-28]。饑餓、缺氧等應激條件下調PI3K/AKT/mTOR通路，mTOR下調誘導并激活細胞自噬。而體外培養大鼠顆粒細胞給予FSH或直接體內注射FSH，AKT磷酸化增加，FSH介導的S6K磷酸化增加，LC3Ⅱ表達下降。Sirt1-Foxo自噬通路提高卵巢顆粒細胞抗氧化應激能力，因其異常可能引起卵泡閉鎖。p53/AMPK信號通路亦是是調控細胞自噬的重要通路。p53是一種人體腫瘤抑制因子，在細胞質和細胞核中對細胞自噬具有雙向調節作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）是生物能量代謝調節的關鍵分子。p53/AMPK信號通路在調控卵泡顆粒細胞自噬中發揮著重要作用，對于恢復卵巢顆粒細胞數量，維持卵巢功能，平衡卵泡微環境自身穩態，促進PCOS卵泡發育成熟及排卵具有重要意義。

Beclin-1和Bcl-2在細胞自噬和凋亡中具有重要的調節作用，二者受蛋白水平及磷酸化程度的影響，雙向調控細胞自噬活性水平，導致卵泡閉鎖或者過度消耗[29]。Beclin-1蛋白參與早期自噬體的形成，通過與Bcl-2蛋白結合，下調細胞自噬活性水平;反之，Bcl-2磷酸化降低了與Beclin-1蛋白的親和力，通過增加游離Beclin-1蛋白水平，上調細胞自噬活性水平。研究發現Beclin-1 mRNA在PCOS患者顆粒細胞中呈高表達，并與獲卵數、體質量指數（body mass index， BMI）呈弱正相關，即獲卵數越多，BMI越大，顆粒細胞自噬活性越高[30]。且非妊娠PCOS患者自噬活性較妊娠PCOS患者更高，而游離雄激素、胰島素或BMI與子宮內膜表達Atg3、Atg4呈負相關。最新研究表明行ICSI治療的PCOS患者卵泡顆粒細胞自噬相關基因Beclin-1和Atg7表達較非PCOS患者顯著增高，Beclin-1基因表達與血清、卵泡液睪酮（testosterone，T）和血清抗苗勒氏管激素（anti-mullerian hormone， AMH）水平呈顯著正相關[31]。顆粒細胞自噬異常活躍，且與PCOS患者高激素內分泌失調及血清AMH異常高表達密切相關，可能是PCOS發病的重要機制，但其參與PCOS卵泡發育及內分泌調控的作用機制和影響因素仍有待進一步闡明。另有研究表明PCOS患者顆粒細胞凋亡的發生率亦高于正常人群[32]。顆粒細胞的凋亡與自噬密切相關，顆粒細胞可能通過自噬形成自噬體積累并引起凋亡，進一步影響PCOS患者卵泡發育。

據統計，PCOS患者中40%存在自然流產史，且復發性流產的發病率明顯增高，PCOS患者行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer， IVF-ET）治療者卵子與胚胎質量顯著下降，術后合并OHSS風險增高[33-34]。顆粒細胞自噬率在PCOS患者中呈高表達，研究提示顆粒細胞自噬率過高，Atg表達過強，可能是PCOS卵泡發育異常及性激素合成失調的重要影響因子，并與PCOS患者臨床自然流產發生率增高和輔助生殖中發生OHSS風險增高密切相關[24，33-34]。

維持顆粒細胞內環境自噬平衡，可作為治療PCOS卵泡發育障礙和提高輔助生殖技術（assisted reproductive technology， ART）的新靶點。但諸多問題，如BMI是否通過顆粒細胞自噬影響卵母細胞質量，Beclin-1 mRNA等自噬基因表達與PCOS患者受精率相關性及是否與采用ICSI方案有關等，仍有待進一步研究。此外，還可以通過營養缺乏、藥物干預、自噬基因敲除、沉默或過表達等方法激活或抑制體外培養細胞自噬，進一步探索已知的PCOS發病、內分泌調控、卵泡發育、卵泡閉鎖和卵子排出的影響因子和信號通路與PCOS卵泡顆粒細胞過度自噬之間的關系。

4 中醫藥調控作用機制與理論研究

中醫學無“PCOS”的病名，但根據臨床表現將其歸屬“不孕癥”“閉經”“月經后期”“癥瘕”“崩漏”等范疇。中醫現代醫家認為其發病與腎、肝、脾關系密切，其中腎虛是根本病機，肝郁脾虛、七情內傷以致生殖軸功能失調是內在因素，痰濕、氣滯、血瘀為標，屬本虛標實之證。治療總以補腎為要，輔以健脾疏肝，兼顧調理氣血。中醫“腎主生殖”理論認為腎精是產生卵子和孕育胎兒之根本，腎精化為腎氣，腎陰為卵子成熟提供物質基礎，腎陽為卵子排出提供內在動力。腎精腎氣虧虛是卵子難以發育成熟及排卵功能障礙的根本原因[35]。尤昭玲教授[22]提出女性生殖以“卵巢”為本，PCOS性不孕卵泡發育異常病本在卵巢，以卵巢功能障礙以致卵泡發育時空方面異常為顯著標志，形成了“助卵養泡”的重要學術思想和病、癥、期、時相結合的PCOS整體診治新思路，強調中醫調泡的重點在卵泡期，治尤重腎，針對卵泡發育的時空規律和特性，捕捉生長卵泡，把握調泡時限。

現代研究主要從生殖內分泌調控、卵巢旁/自分泌調控、卵泡代謝組學、細胞凋亡等多方面探索了中醫藥促卵泡發育、改善卵巢功能的作用機制。研究證實補腎中藥可通過促進卵泡發育，抑制顆粒細胞凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能，延緩卵巢衰老等，進而改善各種臨床癥狀。近年來，越來越多學者將細胞自噬與中醫學相聯系，基于“腎主生殖”“肝主疏泄”“陰陽平衡”等中醫理論，開展細胞自噬與中醫理論、中藥臨床療效的相關性研究。黃貴華等[36]認為正常人體內細胞自噬維持在較低水平的自穩狀態。在營養缺乏、情志刺激等不良因素影響下，機體激活細胞自噬，降解衰老受損的亞細胞器和錯誤折疊的蛋白質，供給細胞能量和合成底物，從而促進細胞存活。相當于中醫痰瘀情況下，通過“精化氣”，以發揮氣的推動和防御功能，恢復體內陰陽平衡;祛瘀化痰以消除內生實邪，維持機體生命活動和自我保護。若“精氣轉化”功能失調，細胞過度自噬或自噬不足，將導致“陰陽離決”。白俊等[37]從“腎主生殖”理論與細胞自噬對卵泡發育和閉鎖調控的相關性出發，認為腎精腎氣充足，顆粒細胞和卵母細胞自噬與凋亡比例平衡，卵泡發育成熟并能順利排卵。段恒等[38]研究比較并證實了毓麟珠、溫胞飲、養精種玉湯等經典補腎名方改善IVF-ET中小鼠卵細胞質量，促進卵細胞成熟，其中補益腎氣的毓麟珠作用最為明顯。談勇教授[39]基于中醫“腎主生殖”和夏桂成教授“補腎調整月經周期節律”理論，經后期用滋陰方以補精血，經前期用補陽方以補腎陽，序貫治療PCOS，臨床療效顯著，且研究證實其含藥血清通過提高顆粒細胞培養上清液中雌二醇（estradiol，E2）水平，可以改善PCOS大鼠顆粒細胞分泌功能，通過下調卵泡期干細胞因子（stem cell factor，SCF）基因高表達，調控PCOS卵泡發育及內分泌功能并具有一定的量效關系，為治療PCOS排卵障礙提供了實驗依據。刑玉等[40]最新研究以自噬誘導劑C2-神經酰胺和丙酸睪丸酮（testosterone propionate，TP）作用于顆粒細胞，模擬PCOS的高雄激素水平并建立了PCOS顆粒自噬模型。研究發現：補腎健脾、活血通利中藥通過p53調控細胞自噬相關基因，發揮其抑制顆粒細胞自噬作用優勢，從而降低PCOS大鼠顆粒細胞過度自噬。研究表明補腎中藥能抑制卵巢顆粒細胞的凋亡和過度自噬，減少卵泡閉鎖，改善卵巢儲備功能或PCO狀態，調節血清內分泌性激素水平，恢復卵巢顆粒細胞數量，從而維持卵巢功能，促進卵泡發育[30，41]。

PCOS發病機制復雜，臨床表現多態，闡明PCOS患者高雄激素、高胰島素、高AMH水平、BMI水平與顆粒細胞過度自噬的相關性，揭示補腎中藥維持顆粒細胞自噬平衡與調控卵泡發育的環節、靶點和量效關系，從而糾正PCOS患者內分泌代謝紊亂、促進卵泡發育和排卵的作用機制，有望成為中醫藥診治PCOS的新突破，并在中醫藥ART中發揮重要作用。

5 小結與展望

細胞自噬可能發生在卵泡發育的各個階段，具有Gn依賴性和細胞特異性。顆粒細胞自噬穩態平衡以維持正常人體卵巢功能，參與調控卵泡發育，影響胚胎質量和妊娠結局。PCOS顆粒細胞自噬活性過高，Atg表達過強，與PCOS卵泡發育異常、內分泌代謝紊亂、臨床自然流產率高和ART中發生OHSS 風險率高密切相關，可能是PCOS發病的重要機制，但其影響因子和路徑有待進一步研究。補腎中藥通過抑制PCOS顆粒細胞過度自噬，改善卵巢多囊狀態，調節卵泡發育和生殖內分泌功能，從而維持機體的陰陽平衡，但具體作用機制亟待進一步闡明。完善PCOS細胞自噬模型，探索卵泡顆粒細胞自噬通路與PCOS、卵泡發育、內分泌代謝之間的內在聯系，開展細胞自噬調控機制與中醫理論、臨床療效、作用靶點、物質基礎、影響因子和信號通路等相關性研究，揭示中醫藥治療PCOS、促卵泡發育的分子機制對卵泡內細胞自噬活性、自噬基因及信號通路的影響，從新的視角進一步闡明PCOS發生、發展中潛在的分子機制和中醫藥防治PCOS、干預卵泡發育的作用機制。其結果可能為我們探索PCOS、不孕癥、卵巢早衰及卵泡發育異常等婦科疑難病癥診療方法提供新的思路，并豐富中醫“腎主生殖”“陰陽平衡”理論的科學內涵。

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