菜籽抗氧化肽WDHHAPQLR的環境穩定性研究

姚軼俊 張 晶 鞠興榮 王立峰

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心1，南京 210023)(江南大學食品學院2，無錫 214122)

眾多研究認為食物蛋白來源的抗氧化肽類物質是一類安全性較高的抗氧化劑。目前，國內外學者從不同來源的蛋白質中制備出了具有各種活性的肽類物質，但這些研究主要集中在制備工藝、分離純化、功能鑒定及構效關系等方面[1-3]，而有關加工儲藏條件對多肽活性的影響卻研究較少[4]。多肽作為蛋白質的降解衍生物，性質與蛋白質類似，都很容易受到環境因素的影響，如在生產、加工及儲藏過程中可能會因氧化、脫酰胺、水解或環化等作用而發生降解，導致其活性下降甚至完全喪失，這將影響到肽類產品的開發應用，所以研究多肽類物質穩定性存在的環境條件可以為多肽的生產加工提供參考[4]。

劉丹[5]分析了大豆多肽的穩定性，結果顯示高溫、金屬離子和強堿性環境不利于多肽活性的保持，同時添加的少量的檸檬酸可以使此多肽羥基自由基清除活性增強。此外，在胃腸道消化過程中多肽很可能會受到胃腸液中的胃蛋白酶、胰蛋白酶以及食物消化過程中產生的Fe、Cu、H2O2、NO、血紅素、脂質過氧化物等物質的影響，使其結構發生變化而失活。朱淑云等[6]考察了水飛薊粕蛋白酶解物的穩定性，結果表明添加食鹽、蔗糖、葡萄糖等對DPPH自由基清除活性影響不大，但經胃液消化后DPPH自由基清除活性明顯降低，經腸液消化后后DPPH自由基清除活性增強。陳亮等[7]研究了溫度、pH及腸胃環境對玉米低聚肽穩定性的影響，結果顯示溫度及pH對多肽的穩定性影響較小，基本上不受腸胃消化環境的影響，能保持較高的生物活性。賈俊強等[8]考察了溫度、pH、干燥方式和體外腸道酶消化對蠶蛹源 ACE 抑制肽穩定性的影響，分析發現此多肽在高溫、酸性和堿性環境下不穩定，易失活，冷凍和噴霧兩種干燥方式對多肽的活性影響很小，同時此多肽具有較強的耐蛋白酶消化的能力。因此，研究多肽在加工、儲藏及胃腸道中的穩定性，對于理論和實踐方面有重要意義。

本研究以Alcalase 2.4L酶解“雙低”油菜籽寧雜19號得到的菜籽蛋白酶解物(rapeseed protein hydrolysate，RPH)為原料，通過超濾和凝膠色譜分離其活性肽組分，對酶解液及各分離組分進行抗氧化活性研究及多肽序列鑒定，發現抗氧化肽WDHHAPQLR具有較高的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑應用于食品加工中，同時還可以作為功能性食品添加劑[9]。然而作為食品添加劑，其在食品儲藏過程及其在人體內環境中的穩定性研究都顯得尤為重要。因此在前期研究的基礎上，研究食品環境如pH、食品配料成分、金屬離子、防腐劑以及模擬利用過程中體外胃腸消化等因素對菜籽抗氧化肽WDHHAPQLR穩定性的影響，旨在為菜籽抗氧化肽作為抗氧化劑在后續試驗、生產、儲藏及功能性利用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽肽WDHHAPQLR由實驗室利用Alcalase 2.4 L水解菜籽蛋白后得到菜籽蛋白水解物，并經過超濾膜分離、凝膠色譜(Sephadex G-15)和RP-HPLC分離純化制得[9]。

菲洛嗪、DPPH、蔗糖、檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、胃蛋白酶、胰蛋白酶；NaCl、CuSO4、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、NaOH、HCl等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋、PHS-3C雷磁pH計、Milli-Q純水機、SpectraMax M2e酶標儀、QL-861漩渦振蕩器。

1.3 實驗方法

1.3.1 DPPH·自由基清除活性的測定

用無水乙醇配制0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度(2，4，6，8 mg/mL)的樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用VC作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率按照式(1)計算：

(1)

式中：A0表示2 mL無水乙醇+ 2 mL DPPH溶液的吸光值；A1表示2 mL樣品溶液+ 2 mL DPPH溶液的吸光值；A2表示樣品溶液+ 2 mL無水乙醇的吸光值。

1.3.2 Fe2+-螯合金屬離子能力的測定

實驗方法參照Dinis的相關文獻[10]，并進行了一定的修改。用蒸餾水分別配制濃度為2 mmol/L的FeCl2溶液和5 mmol/L ferrozine溶液；將1 mL待測溶液與0.05 mL FeCl2溶液、0.2 mL ferrozine溶液混合均勻，室溫下放置10 min，測定溶液在562 nm下的吸光值。對照組以去離子水代替樣品，同時每組設置5個平行。Fe2+-螯合金屬離子能力按照式(2)計算：

Fe2+-螯合金屬離子能力=(A0-A1)/A0×100%

(2)

式中：A0表示對照組的光密度值；A1表示樣品的光密度值。

1.3.3 抗氧化肽活性保持率計算

分別測定菜籽抗氧化肽處理前的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力A0，然后測定經不同處理后的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力A1，按式(3)計算：

活性保持率=A1/A0×100%

(3)

1.3.4 溫度對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別放置于20、40、60、80、100 ℃的水浴鍋中保存1 h后冷卻至室溫分別測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.5 pH對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別調pH值為2、4、6、8、10、12，在室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.6 食品配料成分對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，在溶液分別添加NaCl、檸檬酸、蔗糖。其中，NaCl的質量分數為1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%；檸檬酸的質量分數為0.02%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%；蔗糖的質量分數為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%；室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.7 金屬離子對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別添加50、100、150、200、250 μg/mL的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+，室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.8 防腐劑對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，在溶液中分別添加苯甲酸鈉和山梨酸鉀，使其質量分數為0.02%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%，室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.9 胃-腸道蛋白酶對抗氧化肽穩定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液。實驗方法參照文獻[11]，并進行了一定的修改。胃蛋白酶消化：用1 mol/LHCl將肽液的pH值調至2.0，加入4%的胃蛋白酶在37 ℃下水浴2 h后，煮沸10 min終止消化，冷卻至室溫后離心(10 000 g，10 min)，將上清液分為2份，一份測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力，另一份繼續用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化：將胃蛋白酶消化后的上清液的pH值調至7.5，加入4%的胰蛋白酶在37 ℃下水浴2 h后，煮沸10 min終止消化，冷卻至室溫后離心(10 000 g，10 min)，收集上清液，測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.4 數據處理

每組試驗均重復3 次，結果表示為平均值±標準偏差。利用SPSS17.0 統計軟件進行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 溫度對抗氧化肽穩定性的影響

溫度對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖1所示，在20～60 ℃時，DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力的保持率先上升后下降，但是變化幅度不大，活性保持在較為穩定的狀態；在60～80 ℃時，活性保持率急劇下降，在溫度達到100 ℃時，Fe2+-螯合金屬離子能力活性保持率僅在30%左右。只有一些分子質量大于等于50 ku的蛋白質可以形成四級結構，所以分子質量較小的一些短肽不具備三級和四級結構[12]，但是這些短肽仍然可以形成二級結構，這也是抗氧化肽具有活性的重要影響因素。處理溫度過高、時間過長可能會使抗氧化肽的二級結構發生變化，導致活性大幅度下降。

圖1 溫度對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.2 pH對抗氧化肽穩定性的影響

pH對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖2所示，抗氧化肽在中性環境(pH為6～8)時，具有較高的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力保持率。在酸性和堿性環境中都會使得抗氧化肽的活性大幅度降低，從下降的趨勢中可以看出堿性環境的影響更為明顯。一般來說，每一個多肽都有其最適的酸堿范圍，在此范圍內抗氧化肽的活性和結構可以保持相對穩定[13]，這表明該抗氧化在應用時應避免過酸或過堿的環境。

圖2 pH值對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.3 食品配料成分對抗氧化肽穩定性的影響

NaCl、蔗糖和檸檬酸對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如表1所示。從表1中可以看出，在NaCl質量分數在1%～6%范圍內時，DPPH自由基清除活性保持率先上升后下降，但是變化幅度較小，在NaCl質量分數達到6%時，活性保持率較高為93.89%，在NaCl質量分數達到8%時，活性明顯下降，保持率為86.33%；在實驗濃度范圍內，NaCl含量對Fe2+-螯合能力影響不明顯，活性保持率均在90%以上；因此，可以推斷在NaCl質量分數低于6%時，對菜籽抗氧化肽的穩定性無顯著影響。原因可能是中性鹽NaCl在水溶液中電離的Na+和Cl-能中和菜籽肽表面的大量電荷，破壞水化膜從而影響其抗氧化活性[14-16]。在蔗糖質量分數在2%～10%范圍內時，菜籽抗氧化肽的DPPH自由基清除活性隨著質量分數的增加而大幅度下降，在蔗糖的質量分數達到10%時，活性保持率僅為70.27%；而蔗糖質量分數在2%～8%范圍內時，Fe2+-螯合能力的也隨著質量分數的增加而顯著下降，但是當質量分數在8%～10%時，活性保持率則趨于穩定。原因可能是蔗糖不屬于還原性糖，而且常溫條件下蔗糖也無法水解。因此，蔗糖與菜籽肽無法發生美拉德反應而使肽的結構發生改變，因而對抗氧化活性沒有明顯影響[17-19]。在檸檬酸質量分數在0.02%～0.16%范圍內時，對DPPH自由基清除活性和Fe2+-螯合能力的影響均不明顯，其活性保持率始終在90%以上。

表1 食品配料對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.4 金屬離子對抗氧化肽穩定性的影響

金屬離子(K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+)對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖3所示，從圖中可以看出不同金屬離子對菜籽抗氧化肽的活性作用效果不同。其中，對DPPH自由基清除活性的的影響順序為Zn2+>Cu2+>Ca2+>Mg2+>K+(圖3a)。當金屬離子濃度為250 μg/mL時，K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+溶液的活性保持率分別為(83.91±1.70)%、(58.42±0.86)%、(80.68±2.35)%、(51.93±1.46)%和(55.17±1.62)%，表明金屬離子會顯著地降低菜籽抗氧化肽的DPPH自由基清除活性，同時發現K+和Mg2+對菜籽抗氧化肽活性的影響效果較小。同理，圖(3b)中金屬離子對Fe2+-螯合金屬離子能力的影響順序為Cu2+> Zn2+> Mg2+>Ca2+> K+。當金屬離子濃度為250 μg/mL時，K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+溶液的活性保持率分別為(85.37±0.86)%、(80.54±2.37)%、(63.44±1.67)%、(46.02±1.24)%和(41.72±0.74)%，表明Zn2+和Cu2+對菜籽抗氧化肽的Fe2+-螯合金屬離子影響較大。因此，菜籽抗氧化肽的加工和保存過程中要減少與富含Zn2+和Cu2+的材料的接觸。

圖3 金屬離子對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.5 防腐劑對抗氧化肽穩定性的影響

苯甲酸鈉和山梨酸鉀是食品中常用的防腐劑，其對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖4、5所示。在我國食品添加劑使用標準規定的使用量范圍內，苯甲酸鈉和山梨酸鉀對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)的活性保持率影響作用均不明顯；當防腐劑的質量分數達到0.16%時，活性保持率在90%以上，這說明菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性對苯甲酸鈉和山梨酸鉀穩定，在該產品生產中可用作防腐劑。

圖4 苯甲酸鈉對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

圖5 山梨酸鉀對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.6 胃-腸道蛋白酶對菜籽抗氧化肽穩定性的影響

胃蛋白酶、胰蛋白酶對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如表2所示，在經過2 h的胃蛋白酶消化后，抗氧化肽液的活性明顯增強，這可能是因為胃蛋白酶將肽段水解成小片段，使得肽段的一些內部基團暴露出來，例如一些疏水性基團，而疏水性基團可以顯著的增強抗氧化肽和不飽和脂肪酸之間的反應，提高抗氧化肽的活性[19-20]。然而，在使用胰蛋白酶進一步水解后，抗氧化肽液的活性明顯下降。由于抗氧化肽的結構較為復雜，目前還無法確定在水解過程中有哪些結構被改變，因此還需要后續實驗進一步的探究。

表2 胃腸道蛋白酶對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

3 結論

以DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力為指標來考察溫度、酸堿度、食品配料成分、金屬離子、防腐劑和人工胃腸液等環境因素對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)穩定性的影響。結果表明：隨著溫度的升高，抗氧化肽的活性逐漸降低，但還是保持在較高水平，但是當溫度高于60 ℃時，菜籽抗氧化肽的活性顯著降低，溫度為100 ℃時，Fe2+-螯合金屬離子能力活性保持率僅在30%左右。強酸和強堿環境對抗氧化肽的穩定性影響較大，當溶液的pH在6.0～8.0范圍內時，活性較為穩定?？寡趸娜芤旱幕钚噪S著食鹽濃度的增大而有所降低，當食鹽的濃度達到8%時，抗氧化肽的活性保持率為86.33%。蔗糖質量分數在2%～8%范圍內時，菜籽抗氧化肽的活性隨蔗糖含量的增加而顯著下降，在蔗糖質量分數達到8%，活性保持率在80%以上。在0.02%～0.16%范圍內，檸檬酸對菜籽抗氧化肽的活性影響不大，其活性保持率均在90%以上。常見的金屬離子對菜籽抗氧化肽的穩定性影響不一，Cu2+和Zn+對菜籽抗氧化肽的DPPH·自由基清除活性和亞鐵離子螯合能力的影響最為顯著。苯甲酸鈉和山梨酸鉀對抗氧化肽的穩定性影響不明顯，可以在多肽產品中作為防腐劑使用；菜籽抗氧化肽溶液經過胃蛋白酶消化后抗氧化活性顯著增加，再經過胰蛋白酶消化后活性大幅度下降。然而由于抗氧化肽的結構較為復雜，目前還無法確定在水解過程中有哪些結構被改變，因此還需要后續實驗從模擬消化、小腸上皮細胞轉運等方面進一步的探究。