高粱堿溶蛋白ACE抑制肽的制備及其穩(wěn)定性研究

周劍敏 尹方平 于 晨 湯曉智

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(ACEIP)與血管緊張素Ⅰ(AngI)的結(jié)構(gòu)相似，都是ACE的競(jìng)爭(zhēng)性底物，在體內(nèi)與ACE結(jié)合阻止了血管緊張素ⅠAngII 的生成，從而緩解和抑制血壓的升高，所以ACEIP又被稱為降血壓肽[1]。1965年Ferreira等首次從蛇的毒液里分離出天然血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽，從此科學(xué)界開始了對(duì)天然來(lái)源ACE抑制肽的研究[2]。1979年，Oshima等首次由利用細(xì)菌膠原酶水解明膠獲得食源性ACE抑制肽，并且有較強(qiáng)抑制活性[3]。由于食源性ACE抑制肽與合成的ACE抑制肽相比，具備食用安全性高、低毒副作用、降壓效果溫和專一以及對(duì)血壓正常者無(wú)任何不良影響等優(yōu)勢(shì)，而受到研究者的廣泛關(guān)注，成為控制和治療高血壓研究的熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)ACE抑制肽研究成果豐富，多種動(dòng)植物蛋白如魚皮明膠[4]、豬血紅蛋白[5]、毛蝦[6]、燕麥[7]、蕎麥[8]、芝麻[9]、花生[10]等中均分離純化得到ACE抑制肽。

中國(guó)是高粱主產(chǎn)國(guó)之一，有豐富的高粱種質(zhì)資源，因此有可靠的高粱蛋白來(lái)源。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于高粱蛋白以及高粱蛋白肽的研究報(bào)道相對(duì)較少。Kamath 等用胰凝乳蛋白酶水解高粱醇溶蛋白后，從水解液中分離得到四種具有ACE抑制活性的組分[11]；Filho 等從高粱蛋白中分離純化出一種分子量為2 000Da的抗病毒肽[12]。本研究以高粱為原料，通過(guò)堿法提取高粱堿溶蛋白，研究不同蛋白酶以及酶解工藝對(duì)于ACE抑制肽的制備及ACE抑制率的影響，同時(shí)對(duì)ACE抑制肽在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，明確以高粱蛋白來(lái)源的ACE抑制肽的最佳提取工藝及其穩(wěn)定性，為高效合理利用高粱蛋白和開發(fā)ACE藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：高粱：安徽燕之坊食品有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma-Aldrich公司；Alcase堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶：諾維信公司；L-酪氨酸：索萊寶公司。

主要試劑：鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、酪氨酸、碳酸鈉、福林酚試劑、三氯乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

上海嘉定糧油錘式旋風(fēng)磨；Molecular酶標(biāo)儀；D-3紫外檢測(cè)儀；pHS-3C精密數(shù)顯pH計(jì)；予華恒溫加熱磁力攪拌器；湘儀高速冷凍離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 高粱堿溶蛋白的制備

脫殼高粱米經(jīng)粉碎過(guò)60目篩得到微細(xì)高粱粉。稱取高粱粉置于石油醚中(1 ∶7)在室溫條件下振蕩8 h后40 ℃低溫烘干。取脫脂后高粱粉于燒杯中，加入濃度為0.15% NaOH溶液使得料液比為(1 ∶14)，于40 ℃下反應(yīng)1.5 h，5 000 r/min離心20 min，使用試劑盒測(cè)定上清液的蛋白含量。上清液冷卻后調(diào)節(jié)pH為5.0，靜置1.5 h，離心取沉淀，繼續(xù)將沉淀水洗并離心3次，棄去上清液，冷凍干燥后即得高粱堿溶蛋白質(zhì)。

1.3.2 蛋白酶活力測(cè)定

酶活力單位是指在一定溫度和pH條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量。本實(shí)驗(yàn)采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力[13]，通過(guò)繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照測(cè)定酶活力。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 酶解工藝流程

配制5 mg/mL的高粱蛋白溶液分散于各蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和Alcase堿性蛋白酶)的最適pH緩沖液中。置于恒溫加熱磁力攪拌器上，反應(yīng)溫度為各蛋白酶的最適溫度(各蛋白酶的最適pH和溫度見(jiàn)表1)，加入蛋白酶后低速攪拌反應(yīng)2 h，沸水浴滅酶15 min。待溶液冷卻后于5 000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，上清液即酶解液。

1.3.4 水解度的測(cè)定

取完全水解液0.1～1.0 mL于25 mL 比色管中，蒸餾水稀釋至4.0 mL，加pH 8 緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，混勻，沸水浴加熱15 min，冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL。570 nm測(cè)吸光度(以水作參比)。另取100 mg蛋白加水100 mL，過(guò)濾，取相應(yīng)體積的濾液，按上述方法測(cè)光密度值。相同體積樣品的光密度之差與蛋白質(zhì)量做工作曲線，取線性部分做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1.0 mL酶解液稀釋至100 mL，取稀釋后水解液4.0 mL，測(cè)吸光度。另取相同濃度未水解蛋白溶液3.0 mL，按上述方法測(cè)吸光度，以二者光密度之差從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查蛋白質(zhì)含量。按公式計(jì)算水解度[14]：

(1)

式中：A為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得蛋白質(zhì)量/mg，W為高粱蛋白粉質(zhì)量/g，V1為水解液總體積/mL，V2為顯色時(shí)所用稀釋液體積/mL。

1.3.5 ACE抑制肽體外活性測(cè)定(FAPGG法)

參考Shalaby等[15]的方法，使用FAPGG為反應(yīng)底物，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定并計(jì)算ACE抑制率。將1.0 mmol/L FAPGG 溶解于pH為7.5、包含0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl中配制底物溶液，置于37 ℃水浴鍋中保溫。取10 μL酶解液加入96孔酶標(biāo)板中，然后加入 150 μL的底物溶液后，迅速放入酶標(biāo)儀中，于340 nm下的測(cè)定吸光值，每30 s記錄一次，共30 min。空白組以10 μL的緩沖液代替酶解液，對(duì)照組以10 μL的0.25 U/mL的ACE溶液代替酶解液。以吸光值變化(ΔA) 對(duì)時(shí)間作出曲線，計(jì)算斜率。計(jì)算公式為：

(2)

1.3.6 不同蛋白酶水解高粱蛋白酶解液ACE抑制活性的比較

選取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和Alcase堿性蛋白酶對(duì)高粱蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)。通過(guò)水解度、ACE抑制活性的測(cè)定，比較不同蛋白酶的水解效果，選擇制備高粱蛋白ACE抑制肽的最佳用酶。

1.3.7 高粱蛋白酶解工藝條件優(yōu)化

1.3.7.1 單因素實(shí)驗(yàn)

固定其他反應(yīng)條件，分別改變酶量(800～4 800 U/g蛋白質(zhì))、反應(yīng)溫度(25～75 ℃)、pH(6.0～9.0)和酶解時(shí)間(0.5～5 h)，以酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為指標(biāo)，分析各因素對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，確定各單因素的最佳條件。

1.3.7.2 響應(yīng)面法優(yōu)化高粱蛋白酶解工藝條件

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert8.0軟件與根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(RSM)，優(yōu)化工藝參數(shù)，確定制備ACE抑制肽的最佳工藝。

1.3.8 高粱蛋白ACE抑制肽的穩(wěn)定性測(cè)定

依據(jù)最佳條件制備高粱蛋白ACE抑制肽粗肽粉，配制5 mg/mL的高粱ACE抑制肽溶液，置于不同的環(huán)境中，以蛋白質(zhì)水解液的ACE抑制率為考察指標(biāo)，分別考察溫度、pH和體外模擬胃腸道酶系對(duì)ACE抑制穩(wěn)定性的影響。具體條件：將高粱蛋白溶液分別置于 20、40、 60、80、100 ℃水浴中保溫2 h，冰水浴冷卻，測(cè)定 ACE 抑制率；將高粱蛋白溶液的pH分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0和10.0，在4 ℃條件下冷藏保存 24 h 后，調(diào)節(jié) pH 為 7.0，測(cè)定 ACE 抑制率；將高粱 ACE 抑制肽溶解于0.1 mol/L的HCl緩沖液(pH 2.0)中，配制成5%(m/V)溶液并加入適量的胃蛋白酶。在37 ℃水浴條件下水解3 h后，沸水浴滅酶10 min，冷卻后用2 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，5 000 r/min離心15 min，測(cè)定上清液的ACE 抑制率，取離心前pH值為7.0的溶液，加入適量胰蛋白酶，37 ℃水浴條件下繼續(xù)水解3 h后，沸水浴滅酶 10 min，冷卻后，5 000 r/min離心15 min，測(cè)定上清液的ACE抑制率。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin8.0和SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用Tukey法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，結(jié)果以XSD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，計(jì)算得到各蛋白酶活力如表1。

表1 酶活力的測(cè)定結(jié)果

2.2 不同蛋白酶水解高粱蛋白產(chǎn)物的水解度以及ACE抑制活性

由表2可知選擇不同的蛋白酶酶解高粱蛋白的水解物都有一定的ACE抑制活性，說(shuō)明以高粱蛋白為原料可以有效制備ACE抑制肽。

相對(duì)于其他蛋白酶，堿性蛋白酶水解高粱蛋白的產(chǎn)物具有最高水解度和最高ACE抑制率，分別為12.22%和72.13%。堿性蛋白酶具有高溶解性和高耐熱性，其作用位點(diǎn)為羧基側(cè)具有芳香族或疏水性氨基酸[16]，這使得堿性蛋白酶能夠針對(duì)性的作用于高粱蛋白，從而提升了水解度和ACE抑制率[17]。所以本研究選擇堿性蛋白酶作水解高粱蛋白制備ACE活性肽，并以ACE抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件。

表2 不同蛋白酶水解高粱蛋白的水解度及ACE抑制活性

2.3 堿性蛋白酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

由圖2可知，當(dāng)堿性蛋白酶添加量在800～2 400 U/g范圍內(nèi)，隨酶量的增加，水解產(chǎn)物的ACE抑制率顯著上升。當(dāng)酶量大于2 400 U/g時(shí)，繼續(xù)增大酶量，水解產(chǎn)物的ACE抑制率之間無(wú)顯著差異。高粱蛋白在堿性蛋白酶的作用下水解成為具有功能活性的短肽，當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔儯噶刻幱?00～2 400 U/g時(shí)，底物未能充分與堿性蛋白酶結(jié)合，生成的形成活性的水解產(chǎn)物少，ACE抑制率低；酶量增加時(shí)，更多的高粱蛋白被堿性蛋白催化水解，形成更多具有ACE抑制活性的短肽，使水解產(chǎn)物的ACE抑制率增加；當(dāng)酶量大于2 400 U/g時(shí)，底物與堿性蛋白酶的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)繼續(xù)加大酶量，水解產(chǎn)物的ACE抑制率變化不大。

圖2 酶量、pH、溫度和酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響

堿性蛋白酶活性反應(yīng)體系對(duì)pH值的變化較敏感。如圖2所示，pH值低于8.0時(shí)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率隨體系pH值的上升而顯著增加，在pH值為8.0時(shí)有最大抑制率，為73.47%。當(dāng)pH高于8.0時(shí)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率開始降低。可能因?yàn)閜H8.0是堿性蛋白酶進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)的最適pH值，此時(shí)酶活性最強(qiáng)，水解效率最高，水解產(chǎn)物中含有更多的活性短肽，ACE抑制率高，但當(dāng)pH低于或高于8.0時(shí)，堿性蛋白酶的活性下降，高粱蛋白被堿性蛋白催化水解效率下降，具有ACE抑制活性的短肽減少，ACE抑制率降低。

溫度是影響酶促作用的關(guān)鍵因素。如圖2所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，水解產(chǎn)物的ACE抑制率增加顯著，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率最大，為70.11%。隨著溫度的升高，堿性蛋白酶的活性增大，同時(shí)由于熱運(yùn)動(dòng)與底物的接觸幾率增大，水解效率增加，ACE抑制活性也隨之增加，但當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度55 ℃后繼續(xù)升高，過(guò)高的反應(yīng)溫度導(dǎo)致堿性蛋白酶變性失活，底物不能被有效水解，進(jìn)而降低了水解產(chǎn)物的ACE抑制率[18]。

由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在0.5～2 h范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率隨著酶解時(shí)間的增加而顯著增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2 h之后，水解產(chǎn)物的ACE抑制率變化不顯著。因?yàn)槊附獬跏茧A段，底物濃度較高，堿性蛋白酶未能與底物充分結(jié)合，水解產(chǎn)物的ACE抑制率低，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的底物被堿性蛋白酶水解為具有ACE抑制活性的短肽，水解產(chǎn)物的ACE抑制率增加；當(dāng)?shù)孜镏饾u被轉(zhuǎn)化完全后，反應(yīng)飽和，水解產(chǎn)物的中ACE抑制肽含量不再增加，水解產(chǎn)物的ACE抑制率保持穩(wěn)定。

2.4 酶解高粱蛋白制備ACE抑制肽的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表如表3所示。并以ACE抑制率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表4所示，并利用Design-Expert對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。各個(gè)因素經(jīng)過(guò)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到ACE抑制率(Y)與酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶活力4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=69.68-0.917X1-4.633X2+0.960X3+3.139X4+0.230X1X2-0.754X1X3+0.246X1X4+0.197X2X3+4.015X2X4-1.5X3X4-2.093X12-3.684X22+2.193X32+0.529X42

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

從表5的方差分析結(jié)果可知，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸模型理想，可以用來(lái)擬合反應(yīng)溫度(X1)、反應(yīng)時(shí)間(X2)、pH(X3)和酶活力(X4)這4個(gè)因素對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。R2=0.968 5；R2(Adj)=0.931 8證明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間的擬合性良好。方程的一次項(xiàng)X2、X4對(duì)高粱蛋白水解產(chǎn)物的ACE抑制率影響極顯著，X1影響顯著，影響順序依次為X2>X4>X1；二次項(xiàng)X12、X22、X32以及交互項(xiàng)X2X4、X3X4均有顯著的影響。這說(shuō)明響應(yīng)值的變化十分復(fù)雜，這4個(gè)因素對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響并不是簡(jiǎn)單的線性相關(guān)關(guān)系，這4個(gè)因素之間存在交互作用。

通過(guò)分析計(jì)算得到堿性蛋白酶水解高粱蛋白制備ACE抑制肽的最優(yōu)酶解條件為：反應(yīng)溫度55.5 ℃，酶解時(shí)間1.68 h，pH7.95，酶量2 360 U/g，水解產(chǎn)物的ACE抑制率預(yù)測(cè)值為76.84%。在該條件下重復(fù)3次，水解產(chǎn)物的ACE抑制率實(shí)測(cè)值為75.98%，與理論值誤差在1%以內(nèi)，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性能較好，對(duì)實(shí)際操作有一定的指導(dǎo)意義。

表5 方差分析結(jié)果

注：*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)。

2.5 高粱 ACE 抑制肽的溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性

ACE抑制肽的穩(wěn)定性是決定其能否長(zhǎng)期保存以及有效作用的重要影響因素。通常ACE抑制肽體外穩(wěn)定性的考察從溫度、pH 值和模擬胃腸道穩(wěn)定性等多方面進(jìn)行考量，以作為判斷 ACE 抑制肽能否投入生產(chǎn)應(yīng)用的重要標(biāo)準(zhǔn)，如圖3所示。

由圖3A可知，儲(chǔ)存溫度在20～100 ℃之間變化時(shí)，ACE抑制肽的ACE抑制率在70.31%～71.37%內(nèi)小范圍波動(dòng)，說(shuō)明ACE抑制肽的抑制活性受溫度影響不顯著(P>0.05)，ACE抑制肽在一定范圍內(nèi)具有良好的溫度穩(wěn)定性。

由圖3A可知，在pH 2～10范圍內(nèi)，ACE抑制肽的ACE抑制率在68.08%～71.01%之間波動(dòng)，當(dāng)pH為10時(shí)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率為68.08%，相對(duì)于pH 2～8時(shí)顯著降低，這可能ACE抑制肽在堿性環(huán)境下發(fā)生了消旋作用，改變了肽鏈結(jié)構(gòu)，降低了多肽的活性。總體看來(lái)，ACE 抑制肽在酸性和堿性條件下都能夠保持良好的穩(wěn)定性。

由圖3B可知，相對(duì)于未消化的ACE抑制肽而言，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化后，ACE抑制肽的抑制率顯著提升，再經(jīng)胰蛋白酶消化后，ACE 抑制率基本無(wú)變化。這說(shuō)明ACE抑制肽能在胃蛋白酶的水解作用下，進(jìn)一步降解產(chǎn)生更多具有ACE抑制活性的多肽，ACE抑制率上升，所以ACE抑制肽有良好的體外消化穩(wěn)定性。

注：不同的小寫字母代表ACE抑制率對(duì)于處理方式的差異顯著性差異(P<0.05)。圖3 ACE抑制肽的溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性

3 結(jié)論

通過(guò)堿法提取制備高粱堿溶蛋白，利用不同蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，篩選出Alcalase堿性蛋白酶作為高粱蛋白制備ACE 抑制肽的水解用酶。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的ACE抑制率隨著酶量和反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，且水解產(chǎn)物的ACE抑制率在pH 8.0和溫度55 ℃ 時(shí)有最大值。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定高粱蛋白ACE 抑制肽的最佳制備條件：酶解溫度55.5 ℃，酶解時(shí)間1.68 h，pH7.95，酶量2 360 U/g。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際值接近模型預(yù)測(cè)值，說(shuō)明該模型可很好地用于高粱ACE抑制肽的制備。高粱ACE抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性。