南極磷蝦磷脂的分離純化及其對(duì)核桃油的氧化穩(wěn)定性的影響

周 莉 楊 富

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430074)

核桃油是從核桃仁(含油率為58.3%～74.7%)提取的植物油，油色黃亮，具有水果香味。核桃油營(yíng)養(yǎng)豐富，多不飽和脂肪酸含量高(占總脂的78%)[1]，具有降血脂、預(yù)防冠心病、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、提高學(xué)習(xí)記憶力和視網(wǎng)膜反射能力、預(yù)防老年癡呆癥和癌癥等作用[2-4]。 因此，近年來(lái)核桃油作為功能性油脂越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。但是，核桃油中高含量的多不飽和脂肪酸非常容易被氧化，已成為影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和貨架期的重要問(wèn)題。為了延長(zhǎng)保質(zhì)期，目前食品工業(yè)主要使用人工合成的抗氧化劑如2,6-二丁基對(duì)甲酚 (BHT)、叔丁基對(duì)羥基茴香醚 (BHA)、沒(méi)食子酸丙酯 (PG) 和特丁基對(duì)苯二酚 (TBHQ) 等。研究表明這些抗氧化劑能提高核桃油的氧化穩(wěn)定性，但是這些抗氧化劑都具有一定的潛在毒性，其安全性一直是公眾擔(dān)心的問(wèn)題[5,6]。因此，開(kāi)發(fā)和利用天然抗氧化劑已成為當(dāng)今食品科技發(fā)展的方向，也是食品工業(yè)關(guān)注的問(wèn)題。

南極磷蝦油中不僅含有人體所必須的脂肪酸，而且含有豐富的維生素E、維生素A、蝦青素、磷脂質(zhì)、類(lèi)黃酮等功能因子[7]。此外，南極磷蝦油中富含磷脂。磷脂是天然的抗氧化劑，具有較好地抗氧化活性[8-9]。因此，將南極磷蝦磷脂添加到核桃油中，研究南極磷蝦磷脂對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的影響具有重要意義。

本研究采用薄層色譜法將南極磷蝦磷脂的各個(gè)組分進(jìn)行分離純化，然后將南極磷蝦磷脂各組分按照一定的比例添加到核桃油中，考察核桃油在貯藏過(guò)程的氧化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁產(chǎn)自云南大姚縣；核桃油自核桃仁提取精煉而得；南極磷蝦肉由遼寧省大連市海洋漁業(yè)集團(tuán)提供，置于-20 ℃冰箱保存；三氯甲烷、甲醇、無(wú)水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、氫氧化鉀、碘化鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、次氯酸鈉、酚酞、重鉻酸鉀、柱層析硅膠均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭宦蚜字湍X磷脂。

1.2 儀器與設(shè)備

Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀； BL-220H分析天平；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；電子天平 AEL-160；碘量瓶、移液管、滴定管。

1.3 方法

1.3.1 高壓溶劑萃取法提取南極磷蝦油

先將南極磷蝦肉置于冷凍干燥儀中干燥，取1 g經(jīng)冷凍干燥后的樣品與1 g沙子混合均勻后置于10 mL的萃取池中。使用沙子的目的是為了加速兩相之間的溶質(zhì)交換，并填充萃取池空隙以減少溶劑體積。萃取溶劑∶三氯甲烷∶甲醇 (88∶12)；萃取溫度：120 ℃；萃取時(shí)間：5 min；萃取壓力，10.34 MPa。然后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取溶液中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)去除，接著置于氮?dú)庀麓蹈傻玫降妮腿∥铮詈髮⑵渲糜?18 ℃的冰箱貯存[10,11]。

1.3.2 南極磷蝦油液相色譜分析

色譜柱： thermo hypersil silica (150 mm×4.6 mm，3 μm)；流動(dòng)相A為正己烷∶異丙醇 (3∶2)；流動(dòng)相B為水；流速為0.5 mL/min；柱溫室溫；柱溫為25 ℃；霧化氮?dú)鈮毫?10 kPa。檢測(cè)器：蒸汽光散射(ELSD)；進(jìn)樣體積為 20 μL。線性梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

1.3.3 南極磷蝦磷脂各組分的分離純化

采用薄層色譜法對(duì)南極磷蝦磷脂各組分進(jìn)行分離純化，采用硅膠60F254鋁箔板，采用三氯甲烷-甲醇-25%氨水(65∶25∶4)作為層析液，分析洗脫組分中的磷脂種類(lèi)。然后，將薄層層析板置于室溫中5 min，待干燥后，用含20%乙醇的磷鉬酸噴涂，150 ℃加熱。顯色部分與標(biāo)準(zhǔn)樣品(卵磷脂和腦磷脂)對(duì)比，之后將對(duì)應(yīng)的磷脂組分的硅膠刮取，用三氯甲烷萃取，并采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，得到南極磷蝦腦磷脂和卵磷脂[12]。

1.3.4 抗氧化效果研究

采用Schaal烘箱法，在30 g核桃油中加入不同質(zhì)量比例的南極磷蝦油、南極磷蝦磷脂和賴(lài)氨酸，在溫度為(60±1)℃的恒溫烘箱中放置24 d，使其加速氧化，以過(guò)氧化值和酸價(jià)為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)添加劑對(duì)核桃油的抗氧化效果[13]。

1.3.5 核桃油過(guò)氧化值的測(cè)定[14]

準(zhǔn)確稱(chēng)取核桃油2 g于碘量瓶中，冷卻至室溫后，加入30 mL冰醋酸和氯仿的混合液，振蕩使其混合均勻，再加入2 mL KI飽和溶液，振蕩30 s后置于暗處?kù)o置5 min，加入100 mL蒸餾水，振蕩，用Na2S2O3滴定至溶液呈淺黃色，加入3滴淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至無(wú)色，記錄Na2S2O3的體積，計(jì)算得出樣品油的POV值。

過(guò)氧化值=1 000×V×C/2m

其中，V表示滴定消耗的硫代硫酸鈉溶液體積(ml)；C表示硫代硫酸鈉溶液濃度(mol/L)；m表示稱(chēng)取的核桃油的質(zhì)量(kg)

1.3.6 核桃油酸價(jià)的測(cè)定[15]

分別稱(chēng)取含不同濃度南極磷蝦油的核桃油樣品5 g，精確到0.01 g，加入到錐形瓶中，分別加入50 mL乙醇溶液，滴入1-2滴酚酞指示液，搖勻后用標(biāo)定好的氫氧化鉀溶液進(jìn)行滴定至溶液變色時(shí)停止滴定，并且保持溶液15 s內(nèi)不褪色，即為終點(diǎn)。記錄氫氧化鉀溶液消耗的體積，同時(shí)做三組平行實(shí)驗(yàn)。測(cè)量時(shí)間間隔至少為24 h。

酸價(jià)=V×C×56.1/m

式中：V為滴定消耗的KOH溶液體積(mL)；C為KOH溶液濃度(mol/L)；m為稱(chēng)取的核桃油的質(zhì)量(g)；56.1為KOH的摩爾質(zhì)量(mol/g)。

2 結(jié)果分析

2.1 南極磷蝦油的液相色譜圖

建立基于蒸汽光散射檢測(cè)器(ELSD)的高效液相色譜法 (HPLC) 對(duì)南極磷蝦油的磷脂各組分進(jìn)行分離鑒定。圖1表示的是標(biāo)準(zhǔn)樣品(腦磷脂和卵磷脂)的液相色譜圖。通過(guò)對(duì)比可知，南極磷蝦油含有兩種磷脂組分，即腦磷脂和卵磷脂，保留時(shí)間分別在9.4 min和18.7 min，本方法能有效分離鑒定南極磷蝦磷脂，且分離度較好(圖1)。結(jié)果與其他學(xué)者相似[16,17]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖

圖2 南極磷蝦油的液相色譜圖

2.2 南極磷蝦油對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的影響

在核桃油中分別加入質(zhì)量比為0.25%、1%和1.5%的南極磷蝦油，并將這些樣品置于(60±1)℃ 的恒溫條件下加速氧化24 d，取樣分析其過(guò)氧化值和酸值。由圖3可見(jiàn)，對(duì)照組的過(guò)氧化值增長(zhǎng)很快，放置24 d，過(guò)氧化值迅速上升到82.3 mmol/kg，而南極磷蝦油的核桃油樣品的過(guò)氧化值的增加明顯減少，而且隨著添加量的增加，過(guò)氧化值增加越慢。當(dāng)南極磷蝦油的添加量為1.5%時(shí)，過(guò)氧化值僅為48.9 mmol/kg。值得注意的是，當(dāng)添加量分別為0.25%和1%時(shí)，核桃油過(guò)氧化值的增加沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明0.25%的南極磷蝦油添加量就能起到較好地抑制核桃油過(guò)氧化值增加的效果。

圖3 不同質(zhì)量比的南極磷蝦油添加量對(duì)核桃油過(guò)氧化值的影響

圖4 不同質(zhì)量比的南極磷蝦油添加量對(duì)核桃油酸價(jià)的影響

由圖4可見(jiàn)，對(duì)照組的酸價(jià)增長(zhǎng)很快，在(60±1)℃恒溫條件下，放置24 d，酸價(jià)迅速上升到3.06 mg(KOH)/g，而添加了南極磷蝦油的核桃油的酸價(jià)僅為1.89～2.15 mg(KOH)/g。說(shuō)明南極磷蝦油對(duì)核桃油酸價(jià)增長(zhǎng)具有較好的抑制性。當(dāng)南極磷蝦油的添加量為0.25%時(shí)，核桃油酸價(jià)增長(zhǎng)的抑制效果和添加量為1%沒(méi)有顯著性差異，兩者變化相近，酸價(jià)分別為2.15 mg(KOH)/g和2.08 mg(KOH)/g。

綜上所述，當(dāng)南極磷蝦油的最低添加量為0.25%時(shí)，對(duì)核桃油的過(guò)氧化值和酸價(jià)的增長(zhǎng)均有較好的抑制效果，因此，南極磷蝦油對(duì)核桃油具有較好地抗氧化活性。

2.3 南極磷蝦磷脂與增效劑復(fù)配對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的影響

有研究表明，磷脂的抗氧化性能是由于其胺基基團(tuán)或氨基酸殘基與磷脂的氧化產(chǎn)物發(fā)生了羰基反應(yīng)，生成了抗氧化產(chǎn)物[18-20]。為此，我們進(jìn)一步分離純化出了南極磷蝦各磷脂組分(腦磷脂和卵磷脂)，然后考察各種磷脂組分與賴(lài)氨酸在核桃油中的抗氧化協(xié)同效果。

圖5 不同質(zhì)量比的南極磷蝦磷脂組分對(duì)核桃油過(guò)氧化值的影響

圖6 不同質(zhì)量比的南極磷蝦磷脂組分對(duì)核桃油抗氧化作用的酸價(jià)的影響

由圖5和圖6可知，與空白對(duì)照相比，在核桃油中添加了南極磷蝦卵磷脂或腦磷脂都能抑制過(guò)氧化值和酸價(jià)的增加。抗氧化效果從大到小依次是，0.08%腦磷脂+0.02%賴(lài)氨酸、0.1%腦磷脂、0.1%卵磷脂和0.08%卵磷脂+0.02% 賴(lài)氨酸。結(jié)果表明，南極磷蝦腦磷脂體現(xiàn)出顯著的抗氧化能力，尤其是與微量賴(lài)氨酸的復(fù)配增加了抗氧化效果。可能是因?yàn)槟X磷脂的胺基基團(tuán)與氧化產(chǎn)物以及氧化產(chǎn)物與賴(lài)氨酸發(fā)生羰氨反應(yīng)共同生成了抗氧化產(chǎn)物從而提高核桃油的氧化穩(wěn)定性[21-24]。此外，南極磷蝦卵磷脂雖然不含胺基基團(tuán)，但也表現(xiàn)出了抗氧化性能。表明南極磷蝦卵磷脂所含的高度不飽和脂肪酸鏈非常容易被氧化[25,26]，產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物可能會(huì)與核桃油中自身含有的氨基酸殘基或者賴(lài)氨酸發(fā)生羰氨反應(yīng)生成抗氧化產(chǎn)物，增強(qiáng)核桃油穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文研究南極磷蝦油、南極磷蝦腦磷脂、卵磷脂及賴(lài)氨酸的添加對(duì)核桃油的氧化穩(wěn)定性的影響。首先，采用蒸汽光散射檢測(cè)器 (ELSD) 的高效液相色譜法 (HPLC) 對(duì)南極磷蝦油的磷脂各組分進(jìn)行分離鑒定，分析出南極磷蝦油中主要含有卵磷脂和腦磷脂，且分離效果較好。之后，采用了薄層色譜法對(duì)南極磷蝦磷脂各組分進(jìn)行分離純化，得到了南極磷蝦卵磷脂和腦磷脂組分。最后，考察了不同質(zhì)量比例的南極磷蝦油的對(duì)核桃油的抗氧化效果，結(jié)果表明南極磷蝦油能提高核桃油的氧化穩(wěn)定性，而且0.25%的南極磷蝦油添加量就能較好地抑制核桃油過(guò)氧化值和酸價(jià)的增加，隨著濃度的增加，抗氧化性能增加。此外，分析了0.08%腦磷脂+0.02%賴(lài)氨酸、0.1%腦磷脂、0.1%卵磷脂和0.08%卵磷脂+0.02%賴(lài)氨酸的抗氧化效果，結(jié)果表明南極磷蝦磷脂各組分都具有抗氧化能力，都能有效抑制過(guò)氧化值和酸價(jià)的升高，提高核桃油的氧化穩(wěn)定性，尤其是腦磷脂組分及腦磷脂與賴(lài)氨酸的復(fù)配對(duì)核桃油氧化穩(wěn)定性的提高具有顯著的效果。