牡丹油體提取及其穩(wěn)定性研究

李婷婷 李志遠(yuǎn) 孫 靜 陶 俊 趙大球

(揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，揚州 225009)

油體是由單層磷脂膜包裹液態(tài)的三酰甘油(TAG)組合而成，它是植物中儲存油脂的一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]，且存在于幾乎所有積累油的植物組織中。油體密度相較于其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)最小，因而能夠浮于水溶液表層，易于分離[2]，其可為種子的萌發(fā)和幼苗的早期生長發(fā)育提供能量，也可臨時存儲同化產(chǎn)物參與碳源的分配[3]。因其類似于天然脂質(zhì)的作用，油體在食品、藥物和工業(yè)產(chǎn)品等行業(yè)中應(yīng)用廣泛，其乳化劑的性質(zhì)也使得油體在疫苗、化妝品和個人護理產(chǎn)品等方面具有一定的應(yīng)用[4]。此外，在油體中表達具有較高營養(yǎng)功效的外源蛋白或多肽還可以提高種子的營養(yǎng)成分、改善種子的食用品質(zhì)、增加植物的附加值[5]。目前，關(guān)于植物種子中油體提取的研究已有相關(guān)報道。例如，采用水提法可以從大豆中提取穩(wěn)定的油體[6]；采用Tris-HCl法提取出來的亞麻芥種子油體大小均一且穩(wěn)定[7]；楊晶等[8]采用PBS作為提取緩沖液，通過去除蛋白質(zhì)可以得到更加純凈的紅花油體；玉米胚芽采用水萃取提取油體并在初始提取液中應(yīng)用超濾技術(shù)可防止油體聚結(jié)，從而提高油體提取率并保持其自然完整性[9]。由此可見，不同植物提取種子中油體的適宜方法并不相同，因此研究不同植物的油體提取方法十分必要。

牡丹是我國的傳統(tǒng)名花，它不僅具有較高的觀賞和藥用價值，還是近些年新興的木本油料作物。牡丹種子富含脂肪酸，其中α-亞麻酸因為人體必備的脂肪酸而備受人們的關(guān)注[10]。

目前，關(guān)于牡丹籽油的研究主要集中于籽油的提取工藝和精煉技術(shù)[10]、脂肪酸成分及理化特性[11]、牡丹籽油的功效[12]等方面。油體作為植物儲存脂質(zhì)的亞細(xì)胞器顆粒，它的正常發(fā)育是脂肪酸儲存和積累的前提[13]，相反，脂肪酸的含量與組成也影響著油體的化學(xué)與物理性質(zhì)[14]。油桐油體與脂肪酸的研究就表明其脂肪酸含量與油體發(fā)育關(guān)系密切[15]。關(guān)于牡丹脂肪酸的儲存，尤其是油體方面的研究一直鮮見報道。本研究采用分級法[16]和優(yōu)化法[17]對牡丹油體進行提取與比較，在獲得相對較好提取方法的基礎(chǔ)之上，對所提取油體在不同溫度、pH、NaCl濃度、糖濃度等條件下的穩(wěn)定性進行研究，從而對牡丹油體的性質(zhì)進行了解，便于充分利用牡丹籽油中各類脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油體在不同領(lǐng)域的應(yīng)用需求價值。

1 材料與方法

1.1 材料

以栽植于揚州大學(xué)牡丹芍藥種質(zhì)資源圃中的‘鳳丹’為材料，采集花后120天的‘鳳丹’種子用于油體的提取。

1.2 主要儀器與設(shè)備

5810R高速臺式冷凍離心機；IX83熒光顯微鏡；CFX96熒光定量PCR儀；60D數(shù)碼相機。

1.3 方法

1.3.1 油體的提取

分別采用分級法[16]和優(yōu)化法[17]提取牡丹種子中的油體。

分級法：稱取大小適中、色澤一致的種子5 g浸泡5 h后用解剖針除去種皮種胚，在種子中加入20 mL研磨液(0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)并于4 ℃冰上研磨成勻漿離心，在上層加入20 mL漂浮液Ⅰ(0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)，離心后取上層油層加入20 mL去污清洗液(0.1% Tween-20 0.2 mol/L蔗糖，5 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)再次離心，在所得上層中加入20 mL磷酸鈉緩液，離心并收集上層油層于離心管中，加入離子洗脫液(2 mol/L氯化鈉，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)20 mL后于上層加入漂浮液Ⅱ(2 mol/L氯化鈉，0.25 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH= 7.5的磷酸鈉緩沖液)20 mL后離心。收集油層重懸于20 mL尿素，室溫震蕩后加入20 mL 磷酸鈉緩沖液，離心后收集油層于研磨液中加入己烷混勻，再次離心后去掉上層己烷油層重懸于20 mL研磨液，上層加入20 mL漂浮液離心，最終收集油層于10 mL離心管中備用。

優(yōu)化法：取新鮮種子5 g，加6倍去離子水膠體磨均，過濾取出上清液4 ℃，10 000 r/min離心30 min。取上浮物溶于5倍加入0.5 mol/L NaCl和0.4 mol/L蔗糖的pH=7.0的Tris-HCl 0.05 mol/L溶液中攪拌過膠體磨20 min后離心。取上浮物加入5倍去離子水，再加入0.1% tween20充分混合，靜置后離心。取上浮物加入2倍己烷混勻后離心，上層油體分離冷藏4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 油體提取方法的比較分析

對采用上述方法提取的油體外觀、提取率、顯微結(jié)構(gòu)、4 ℃條件下儲存兩周的穩(wěn)定性和油體蛋白組成進行觀察和檢測，從而篩選出相對較好的提取方法。

油體提取率=提取油體的質(zhì)量/種子的質(zhì)量×100%

油體顯微結(jié)構(gòu)的觀察:取少量油體，加蒸餾水稀釋后滴在載玻片上，蓋好蓋玻片，放置在熒光顯微鏡(IX83，奧林巴斯株式會社)下采用40倍物鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)并拍照。

油體在4 ℃下儲存兩周的穩(wěn)定性比較:將利用兩種方法提取出的牡丹油體均放入4 ℃的冰箱中儲存，兩周后取出，將其置于玻片中并觀察、比較其顯微結(jié)構(gòu)。

油體蛋白SDS-PAGE檢測:取兩種方法提取出的牡丹油體樣品各20 μL于EP管內(nèi)，向其中加入20 μL去離子水后再加入10 μL的5 × Loading buffer，混合均勻后于沸水中煮10 min，制備12%的SDS-PAGE液。蛋白樣品經(jīng)上樣緩沖液處理后在每孔中加樣10 μL，用12%分離膠進行SDS-PAGE電泳分離，每塊膠的初始電流強度為20 mA，10 min后改為60 mA，當(dāng)樣品達到膠板底部時結(jié)束電泳，用考馬斯亮藍(lán)G250染色2 h后脫色拍照觀察。

1.3.3 油體的穩(wěn)定性研究

取新提取的油體2 mL，分別進行不同溫度和pH值條件下的處理。將量取的油體部分置于50、70、90 ℃的水浴鍋內(nèi)水浴加熱30 min，另一部分置于用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)的pH值為5.0、7.0、9.0、11.0的樣品中，處理結(jié)束后觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

取新提取的油體20 mL，分別用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)和去離子水(pH=7.0)1∶5稀釋混勻，取前者稀釋過的溶液10 mL依次加入50、100、150、200 mmol/L的NaCl，取后者稀釋后的溶液10 mL以25、50、70、100 mmol/L梯度的糖濃度制備油體懸浮液，后觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油體提取方法的比較

2.1.1 油體外觀和提取率

從外觀上看，兩種方法提取的油體均呈透明狀態(tài)，差異不大。但從提取率上來看，分級法提取油體的提取率僅為10.25%，比優(yōu)化法的提取率低了12.38%。

2.1.2 油體顯微結(jié)構(gòu)及其在4 ℃儲存2周后的穩(wěn)定性

通過對油體的顯微結(jié)構(gòu)觀察可以發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取的油體在提取初期都是大小均一、分散均勻、雜質(zhì)較少、密度大；但將油體在4 ℃儲存2周后，分級法提取的油體出現(xiàn)了大幅度的聚合和皺縮，而優(yōu)化法提取的油體除少部分粒徑增大外仍然能夠保持相對較好的穩(wěn)定性(圖1)。

注：a為分級法提取油體的顯微結(jié)構(gòu)；b為分級法提取油體在4 ℃儲存2周后的顯微結(jié)構(gòu);c為優(yōu)化法提取油體的顯微結(jié)構(gòu)；d為優(yōu)化法提取油體在4 ℃儲存2周后的顯微結(jié)構(gòu)。圖1 油體的顯微結(jié)構(gòu)及其在4 ℃儲存2周后的穩(wěn)定性

2.1.3 油體的SDS-PAGE電泳檢測

對兩種方法提取的油體進行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)2種提取方法對油體中所含的蛋白質(zhì)種類沒有影響，但與分級法相比，優(yōu)化法提取油體的條帶顏色顯著較深(圖2)。

注：M為蛋白marker；1為分級法；2為優(yōu)化法。圖2 兩種方法提取油體的SDS-PAGE電泳檢測

通過對上述油體相關(guān)指標(biāo)的綜合比較，可以發(fā)現(xiàn)優(yōu)化法提取的牡丹油體相對較好，下面將采用優(yōu)化法提取油體進行穩(wěn)定性研究。

2.2 油體的穩(wěn)定性研究

2.2.1 不同溫度對油體穩(wěn)定性的影響

圖3為50、70、90 ℃條件下的牡丹油體，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，油體出現(xiàn)了不同程度地破裂，但總體上油體依然分散均勻、密度大，雜質(zhì)也較少、大小均一。

圖3 不同溫度條件下油體的穩(wěn)定性

2.2.2 不同pH對油體穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為5.0和7.0 時，顯微鏡下的油體粒徑相比pH值為9.0和11.0時要明顯增大，油體有顯著聚集現(xiàn)象，形狀不規(guī)則均一，甚至存在部分破裂，穩(wěn)定性顯著下降；當(dāng)pH值為9.0和11.0時，油體粒徑基本不變，顯微鏡下僅有少數(shù)油體聚集，油體較穩(wěn)定。

圖4 不同pH條件下油體的穩(wěn)定性

2.2.3 不同NaCl濃度對油體穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，牡丹油體的結(jié)構(gòu)及粒徑隨著NaCl濃度的變化而發(fā)生改變。當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時，相較于圖2中未經(jīng)NaCl處理的牡丹油體，其顯微結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯地變化。當(dāng)NaCl濃度在100～200 mmol/L時，牡丹油體的粒徑隨著濃度的增加而變大，油體也逐漸開始聚集和破裂，當(dāng)NaCl濃度增加到200 mmol/L時，牡丹油體已經(jīng)大面積的破裂和聚集，油體大小不均一，雜質(zhì)極多，穩(wěn)定性顯著降低。

圖5 不同NaCl濃度條件下油體的穩(wěn)定性

2.2.4 不同糖濃度對油體穩(wěn)定性的影響

圖6顯示牡丹油體的穩(wěn)定性與糖濃度關(guān)系密切。當(dāng)糖濃度為25 mmol/L時，牡丹油體的結(jié)構(gòu)和粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯地變化，當(dāng)糖濃度為50 mmol/L時，牡丹油體開始出現(xiàn)小部分的破裂，油體粒徑變大，大小不太均一，當(dāng)濃度增加到70～100 mmol/L時，牡丹油體大面積破裂和聚集的現(xiàn)象顯著，相較于未處理過的油體，100 mmol/L糖濃度的牡丹油體中出現(xiàn)了超大油體，大小極不均一，雜質(zhì)極多，穩(wěn)定性顯著下降。

圖6 不同糖濃度條件下油體的穩(wěn)定性

3 討論

本研究采用分級法和優(yōu)化法對牡丹種子中油體進行提取，隨后對油體的外觀、提取率、顯微結(jié)構(gòu)、4 ℃儲存兩周后穩(wěn)定性和油體蛋白組成等指標(biāo)進行比較，最終確定了優(yōu)化法更加適合牡丹油體的提取。單從外觀來看，兩種方法提取的油體均呈透明狀態(tài)，差異不大，但分級法提取的油體透明度更高，這可能是由于其在提取過程中的多步的清洗所致。而就提取率而言，優(yōu)化法的提取率更高，達到22.63%，這主要是由于優(yōu)化法步驟簡單使得油體提取損耗大大降低，而分級法的多步清洗導(dǎo)致油體提取的回收損耗增加。在SDS-PAGE電泳檢測油體蛋白的結(jié)果中，優(yōu)化法提取油體的條帶顏色較深，這可能是由于分級法操作中在去除雜蛋白的同時也對油體蛋白產(chǎn)生了一定的影響，因此優(yōu)化法提取的油體蛋白含量要高于分級法，這也可能是優(yōu)化法的油體提取率要高于分級法的原因。此外，在4 ℃儲存兩周后經(jīng)顯微觀察可知，分級法提取的油體出現(xiàn)了大幅度的聚合和皺縮，而優(yōu)化法提取的油體依舊大小均一、分布均勻，具有較好的穩(wěn)定性。

油體的穩(wěn)定性是由其表面的油體蛋白決定的，油體表面存在電荷，當(dāng)離油體蛋白等電點較近時，油體表面的靜電荷接近于零，油體之間會因靜電聚合作用而發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致油體粒徑增大，形狀不規(guī)則；反之油體不發(fā)生聚集，具有較好的穩(wěn)定性[7]。而油體的穩(wěn)定性容易受到外界環(huán)境的影響，例如溫度、pH值、NaCl和糖濃度等[18]。本研究的結(jié)果顯示，溫度對于牡丹油體的影響不大，在50、70、90 ℃條件下，油體均能保持相對穩(wěn)定，這與花生油體穩(wěn)定性的研究結(jié)果相一致[19]。有研究推測，油體上的油體蛋白與TAG形成“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”[20]，在外界溫度條件升高時，油體蛋白的頭部伸入到TAG內(nèi)部而免受破壞，因此油體在溫度變化的條件下依舊能保持較好的穩(wěn)定性。高紅桃等[7]關(guān)于亞麻芥種子油體的穩(wěn)定性研究表明，油體本身帶負(fù)電荷，以偏堿性的條件處理會使靜電荷量增加，油體之間因斥力較大而能保持平衡且不發(fā)生聚集，相反，在酸性及中性條件下，油體之間因斥力小而容易出現(xiàn)聚集甚至破裂的現(xiàn)象，使其粒徑變大。本研究也證實了pH的變化對牡丹油體的穩(wěn)定性有一定的影響。當(dāng)pH≥9.0時，牡丹油體穩(wěn)定分布；pH≤7.0時牡丹油體穩(wěn)定性被破壞，尤其是當(dāng)pH為5.0時，油體粒徑顯著增大；7.0

本研究通過比較確定了優(yōu)化法為適合牡丹油體提取的方法，并從溫度、pH值、NaCl和糖濃度等幾個因素其研究油體的穩(wěn)定性，通過對牡丹油體性質(zhì)的研究，充分了解和利用牡丹籽油中各類脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油體在食品、藥品、化妝品和個人護理產(chǎn)品等不同領(lǐng)域的應(yīng)用需求價值。

4 結(jié)論

通過對兩種牡丹油體提取方法的比較研究，得出優(yōu)化法更適宜于牡丹油體的提取。在牡丹油體的穩(wěn)定性研究中，溫度、pH值、NaCl和糖濃度對其影響不一，即：溫度對牡丹油體的穩(wěn)定性影響不大，牡丹油體在中性和酸性條件下(pH≤7.0)穩(wěn)定性容易受到破壞，牡丹油體在低濃度的NaCl(50 mmol/L)和糖(25 mmol/L)條件下能夠表現(xiàn)穩(wěn)定。