不同氮源對脫胚玉米擠出物發酵生產檸檬酸的影響

葉向庫，申德超

1(河北農業大學，河北 保定，071001) 2(煙臺大學，山東 煙臺，264005) 3(山東理工大學，山東 淄博，255091)

檸檬酸是目前世界工業用量較大的有機酸之一。食品工業中所使用的檸檬酸主要采用發酵法生產[1]，在過去的100多年中，發酵法生產檸檬酸先后使用薯干粉[2]、木薯粉[3]、淀粉[4]、葡萄糖母液[5]、糖蜜[6]、馬鈴薯[7]、小麥粉[8]和玉米粉[9-11]等作為原料進行生產，人們又嘗試了用菠蘿[12]、角豆莢[13]和甘蔗渣[14]等進行生產。在使用來源豐富的淀粉質原料生產檸檬酸時，都需要將原料中的淀粉先經糊化、液化、糖化過程水解成菌種可以利用的單糖或雙糖后才能被利用。傳統工廠中生產檸檬酸所用原料主要是全籽粒玉米，經粉碎、噴射液化、糖化后用黑曲霉Co827進行發酵生產檸檬酸。本文采用脫胚玉米加酶低溫擠出處理后再經液化、糖化后作為原料，仍以黑曲霉Co827作為發酵菌種。實驗室前期對檸檬酸生產及處理過程中的能耗以及相關的轉化率進行了詳細地分析，以為該法與現有方法相比，有利于玉米的綜合利用，降低糊化能耗，提高檸檬酸產率，節約生產成本，提高企業的經濟效益。但是由于以脫胚玉米為原料，處理后所得發酵液中蛋白質含量較低，只有約0.1%(質量分數)，不能完全滿足黑曲霉發酵過程中對氮源的需要(目前以全玉米為原料，生產發酵液中控制蛋白質含量為0.7%～0.8%(質量分數)，后期需補加氮源。因此本試驗考察脫胚玉米加酶低溫擠出所得發酵液添加不同氮源對檸檬酸發酵過程的影響，得到脫胚玉米加酶低溫擠出物適合檸檬酸發酵的氮源及添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

全籽粒玉米，市購(水分質量分數13.7%、淀粉質量分數71.2%、蛋白質質量分數10.4%、粗脂肪質量分數4.8%)。

脫胚玉米擠出物，脫胚玉米(水分含量13.5%、淀粉含量79.68%、蛋白質含量7.56%、粗脂肪含量0.84%)在原料含水量30%、螺桿轉速110 r/min、擠壓時套筒溫度60 ℃、添加耐高溫α-淀粉酶(3×104U/mL)1.0 L/t的條件下經山東理工大學農產品加工教研室研制的單螺桿擠出機擠出得到。

菌種：黑曲霉Co827，山東萊蕪泰禾生化有限公司提供。

1.2 試驗方法

培養基的制備：取干燥發芽大麥用粉碎機粉碎成大麥芽粉，取適量大麥芽粉于500 mL錐形瓶中，加入3.5倍的蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻，然后放入恒溫水浴鍋中于65 ℃保溫糖化5～6 h，直至碘液不變藍為止。然后保溫真空過濾，得濾液用波美計調波美度到10 °Be，經121 ℃滅菌20 min冷卻后備用。

發酵培養基的制備：

(1)全玉米(對照樣)發酵液培養基：全玉米用粉碎機粉碎至40目篩，未通過量<15%(質量分數)即可，置于容器中加2.5倍的水，加熱至90 ℃，同時每克原料加入10 U的耐高溫α-淀粉酶，恒溫液化至碘液不變藍為止。取液化液保溫真空抽濾，濾過液用10%(體積分數) H2SO4調pH值為4.5，按每克原料加入160 U糖化酶在60 ℃進行糖化，當DE值>90%時糖化結束。該發酵液經121 ℃滅菌20 min冷卻后備用。

(2)脫胚玉米擠出物發酵液培養基：取脫胚玉米擠出物經粉碎機粉碎，置于容器中加2.5倍70 ℃熱水混勻后迅速放于90 ℃水浴鍋中加熱，其余操作與全玉米發酵液培養基制作方法相同。

(3)菌種的活化和擴培：從斜面挑取菌種2～3環接入麥芽汁培養基中，于35 ℃、230 r/min恒溫搖床上通風培養24 h，重新再活化1次，作為菌種發酵液。

檸檬酸的測定：試樣離心后，上清液經0.3 μm濾膜抽濾，以(NH4)2HPO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.7)為流動相，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，用C18色譜柱進行分離，紫外檢測器于210 nm處測定，用峰面積標準曲線對檸檬酸進行定量。

標準曲線的繪制,以檸檬酸標準液濃度為橫坐標，色譜峰峰面積均值為縱坐標，得檸檬酸標準曲線為：Y=82.172X+197.01(R2=0.999 7)。檸檬酸色譜圖如圖1所示。

圖1 檸檬酸標準液的色譜峰形圖Fig.1 Citric acid titer of chromatographic peak graph

蛋白質的測定參照GB/T 5009.5。

還原糖的測定參照GB/T 5009.7。

總糖的測定參照酸水解法。

pH的測定參照pH計測定法。

檸檬酸發酵方法：發酵液置于錐形瓶中，接入10%(體積分數)菌種，35 ℃、230 r/min恒溫搖床上通風發酵72 h，取出測定檸檬酸產量。

1.3 試驗內容

1.3.1 無機氮源對檸檬酸發酵過程的影響

選擇NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4作為無機氮源[15-16]，分別取1、2、3 g/L的添加量進行試驗。

1.3.2 有機氮源對檸檬酸發酵過程的影響

有機氮源分為外源性氮和內源性氮，外源性氮選擇尿素，內源性氮選擇脫胚玉米經液化、糖化后過濾的濾渣。

1.3.2.1 尿素與玉米渣的可行性試驗

尿素可以促進真菌的生長，以生產發酵液總蛋白量為參考，向調整到總糖18%(質量分數)的擠出物玉米糖化液中加入質量濃度6.4 g/L的尿素進行發酵試驗。

同時取18%(質量分數)擠出物玉米糖化液加入相當于質量濃度6 g/L蛋白質的玉米渣作為有機氮源進行發酵試驗。

1.3.2.2 添加玉米渣對檸檬酸發酵過程的影響

按照目前生產中發酵液控制的總蛋白質含量0.7%～0.8%(質量分數)計算，向擠出物制備的發酵液中添加相當于質量濃度1、2、3、4、5、6 g/L蛋白含量的玉米渣。

2 結果與分析

2.1 無機氮源對檸檬酸發酵效果的影響

表1 不同無機氮源對檸檬酸發酵的影響Table 1 Effects of inorganic nitrogen on fermentation

由表1可以看出，向發酵底物中添加一定量的NH4Cl、(NH4)2SO4對黑曲霉發酵檸檬酸有不同程度的促進作用，其中，(NH4)2SO4促進產酸效果尤為顯著，而NH4NO3促進作用不明顯。對(NH4)2SO4和NH4NO3、NH4Cl數據進行t檢驗分析[18](表2、表3)，可以看出，t1(6)=1.616 6>t0.10(6)=1.439 8，t2(6)=1.132 8>t0.25(6)=0.717 6，相對于NH4NO3，(NH4)2SO4對黑曲霉發酵產檸檬酸的影響差異非常顯著，相對于NH4Cl，(NH4)2SO4對黑曲霉發酵產檸檬酸的影響差異較顯著。對比(NH4)2SO4的不同添加量可以看出，當(NH4)2SO4的添加量為3 g/L時，檸檬酸的產率最高。當(NH4)2SO4的添加量超過或者低于3 g/L時促進產酸效果減弱。這與孫榮[19]的試驗結果一致。

表2 (NH4)2SO4與NH4NO3的t檢驗Table 2 t-test of (NH4)2SO4 and NH4NO3

表3 (NH4)2SO4與NH4Cl的t檢驗Table 3 t-test of (NH4)2SO4 and NH4Cl

2.2 有機氮源對檸檬酸發酵效果的影響

2.2.1 尿素與玉米渣可行性試驗結果

添加有機氮源選擇外源性氮和內源性氮。從工業應用的經濟性角度出發，外源性氮首選尿素[10]，內源性氮選擇原料經液化、糖化過濾后蛋白質含量較高的玉米渣為原料，經測定脫胚玉米擠出物經液化、糖化后過濾所得玉米渣中蛋白質含量為23.1%。可行性試驗結果如表4所示。

表4 添加尿素與玉米渣的可行性試驗Table 4 Feasibility test of citric acid production addingurea or corn cinder

由表4可以看出，添加尿素的發酵液樣品經過72 h的發酵產生的檸檬酸只有1.61 g/100 g，鏡檢發現，黑曲霉菌絲球形狀很好，結構緊密，也沒有出現衰老死亡、孢子松散的狀態，無雜菌污染，但活力很低，發酵產酸弱，不能用于檸檬酸生產中氮源的使用，具體原因尚待研究。添加玉米渣的發酵液樣品經過72 h的搖床培養，產生6.45 g/100 g的檸檬酸，發酵狀態比較好，鏡檢發現菌絲球體積明顯增大，外部邊緣不清晰，有松散孢子分散出來，發酵活力減弱，已到發酵終點[20]。可以說明，玉米渣可以作為有機氮源的添加物進行下一步試驗。

2.2.2 添加玉米渣對檸檬酸發酵效果的影響

玉米渣為原料中原有產物，傳統發酵法中為滿足黑曲霉的繁殖和代謝，在發酵初需控制發酵液中蛋白質含量在0.7%～0.8%(質量分數)，脫胚玉米經加酶低溫擠出后，進行液化、糖化、過濾后得到的發酵液中蛋白質含量約0.1%(質量分數)，而玉米渣中含有23.1%的蛋白質。用玉米渣補充氮源，一方面減少廢棄物的排放量和處理費用，另一方面又有利于發酵生產過程的調節作用。

表5 有機氮源對檸檬酸發酵的影響Table 5 Effects of organic nitrogen on fermentation

由表5可以看出，玉米渣隨著添加量的增多，發酵產酸量反而減少，呈負相關性。雖然低溫加酶擠出脫胚玉米制得檸檬酸發酵液中的蛋白質含量并不高，只有約0.1%(質量分數)，遠低于目前生產中使用的0.7%～0.8%(質量分數)的蛋白質含量水平，但添加質量濃度1 g/L玉米渣后檸檬酸發酵良好，經72 h發酵后產酸達到9.82 g/100 g。表明發酵液體系中有滿足黑曲霉菌體生長和代謝產酸所需要的氮源。表明脫胚玉米經過加酶擠出后蛋白質受到了較徹底的破壞，部分發生降解，溶入發酵液中的游離態氮源增多，更利于菌種的吸收利用，雖然總量不多，但可以滿足黑曲霉菌體生長和產酸的需要。

3 結論

(1)以脫胚玉米加酶低溫擠出物制備檸檬酸發酵液，向其中添加無機氮源((NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl)。結果顯示，(NH4)2SO4、NH4Cl對黑曲霉發酵產檸檬酸有促進作用，其中(NH4)2SO4促進產酸效果尤為明顯，當(NH4)2SO4添加量為3 g/L時，檸檬酸的產率達到7.86 g/100 g。

(2)以脫胚玉米加酶低溫擠出物制備檸檬酸發酵液，向其中添加有機氮源(尿素、脫胚玉米淀粉水解后的玉米渣)發現，尿素能維持黑曲霉菌絲球良好狀態，但發酵產酸能力很弱。玉米渣對黑曲霉發酵有明顯影響，隨著添加量的增多，發酵產酸量反而減少，呈負相關性。添加質量濃度1 g/L后檸檬酸發酵良好，經72 h發酵后產酸達到9.82 g/100 g。

(3)脫胚玉米經加酶低溫擠出后制備檸檬酸發酵液，添加無機氮源和有機氮源均對檸檬酸發酵產生影響。從發酵后檸檬酸產率來看，添加有機氮源玉米渣優于添加無機氮源硫酸銨對檸檬酸發酵的促進效果。