頂空固相微萃取-氣質聯用法分析益生菌發酵復合果蔬汁揮發性成分

何嘉敏,于蘭,于新,*,劉學云,江芳,王萍,郭靖

1(仲愷農業工程學院 輕工與食品學院,廣東 廣州, 510225)2(武漢天天好生物制品有限公司,湖北 武漢, 430090)

采用益生菌發酵技術研發具有保健功能的發酵果蔬汁,不僅豐富了果蔬制品的種類,增加了果蔬制品的保健作用,更改善了果蔬制品的風味,使果蔬加工產業有了快速的發展[1]。

甘蔗(Saccharumofficinarum)、番茄(Lycopersiconesculentum)、胡蘿卜(Daucuscarota)均是我國物美價廉的果蔬,且三者均含有多種可溶性糖、氨基酸、人體必需的微量元素及多種對人體有益的有機酸等物質[2-3]。甘蔗含有具抗氧化作用的多酚類物質及較高的糖類物質可以為發酵提供碳源；番茄含有具抗氧化和增強免疫力的番茄紅素，番茄汁也是嗜酸乳桿菌的促生長因子[4-9]。經前期研究發現,這3種復合果蔬經過益生菌發酵之后,能夠產生較好的揮發性成分,而揮發性成分是評價果蔬汁感官質量的重要指標之一[10]。

束文秀等[11]采用靜態-頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用分析方法,測定胡柚汁經此2種乳酸菌發酵后揮發性成分和相對含量變化。本試驗在前期益生菌發酵復合果蔬汁工藝優化的基礎上,采用頂空固相微萃取-氣質聯用法分析復合果蔬汁益生菌發酵前后揮發性成分,并對頂空固相微萃取-氣質聯用法進行優化。為進一步提高和監控發酵果蔬汁制品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗、番茄及胡蘿卜,購于家樂福；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),購于丹尼斯克(中國)有限公司。

1.2 儀器與設備

JD100-3B電子分析天平,上海精科天美科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司；手動SPME進樣器，美國Supelco公司；Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene(PDMS/DVB)萃取頭，美國Supelco公司；Agilent Technologies 6890-5973N氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵果蔬汁的制備

原料預處理：將甘蔗清洗、瀝干，用甘蔗機榨汁備用；將胡蘿卜、番茄去蒂，清洗、瀝干、切塊，用榨汁機榨汁，酶解后備用。

工藝流程：

按V(甘蔗汁)∶V(番茄漿)V∶(胡蘿卜漿)=5∶1∶2裝入500 mL玻璃瓶→酶解→80目濾布過濾→調配至pH 6.7→按V(嗜酸乳桿菌)∶V(嗜熱鏈球菌)∶V(植物乳桿菌)=3∶2∶1,接種量為3%→38 ℃ 恒溫發酵→益生菌發酵復合果蔬汁。

操作要點：試驗用具都需事先消毒,接種需在無菌條件下。

1.3.2 固相微萃取條件的優化

1.3.2.1 萃取溫度的選擇

其他萃取條件不變,將萃取溫度分別設定為40、45、50、55、60 ℃,啟動儀器采集數據,每個樣品重復3次,取平均值。

1.3.2.2 萃取時間的選擇

其他萃取條件不變,將萃取時間分別設定為20、30、40、50、60 min，啟動儀器采集數據,每個樣品重復3次,取平均值。

1.3.2.3 NaCl的加入量

其他萃取條件不變,NaCl的加入量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，啟動儀器采集數據,每個樣品重復3次,取平均值。

1.3.3 GC-MS參數條件

色譜條件：DB-5ms柱石英毛細管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；萃取頭熱解析溫度為250 ℃,時間為3 min,不分流模式。進樣口溫度250 ℃；起始溫度50 ℃,保持1 min；然后以2 ℃/min的速度升溫到180 ℃,保持4 min；再以2 ℃/min的升溫速度升溫到180 ℃,保持4 min。載氣為He,流量1 mL/min。

質譜條件：全掃模式,掃描質量范圍為33～450m/z。電離方式為EI+,電子能量70 eV,燈絲發射電流350 pA,檢測器電壓350 V,離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃[12-13]。每個樣品重復3次,取平均值。

1.3.4 揮發成分的定性定量

香氣成分采用Wiley7n.1質譜數據庫檢索并結合參考文獻[14-16]進行定性分析。用峰面積歸一化法進行各種香氣成分相對含量的計算,即各種香氣物質的峰面積占總揮發性成分總出峰面積的百分數。每個樣品重復3次,取平均值。

1.3.5 數據處理

采用OriginPro 8.5和IBM SPSS 21.0處理試驗數據,表中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 固相微萃取條件的優化

2.1.1 萃取溫度選擇

由圖1可知,隨萃取溫度的升高,總峰面積及總峰數先呈遞增趨勢,溫度達45 ℃為最高點后逐漸降低。可能是萃取溫度對萃取效果影響較大,溫度升高,加快揮發物質的分子運動速率,有利于萃取頭對目標物的吸附[17]；當溫度過高,某些不穩定物質容易分解,影響研究結果[18]。所以選擇萃取溫度45 ℃。

圖1 萃取溫度對益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性成分萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction effect of volatile components of sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics注：不同大小寫字母表示差異顯著。下同。

2.1.2 萃取時間選擇

由圖2可知萃取20～40 min時總峰面積及總峰數呈增長趨勢,40～60 min時總峰面積及總峰數變化不明顯。這可能是因為萃取時間較短時,樣品中揮發性物質不能被萃取頭充分吸附[19]；萃取時間過長,可能導致樣品中某些不穩定化合物發生氧化分解等副反應[20]。故萃取時間應設定為40 min。

圖2 萃取時間對益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性成分萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.1.3 NaCl加入量

由圖3可知,NaCl加入量在0.0～1.0 mg/L時總峰面積及總峰數呈增長趨勢,NaCl加入量在1.0～3.0 mg/L時總峰面積及總峰數呈遞減趨勢?？赡苁且驗檫m量加入NaCl產生鹽析效應降低揮發性成分在水中的溶解度,有助于揮發性成分逸出,增加其在頂空瓶上空的濃度,增加萃取效率；過量加入NaCl,使基質黏度增加,影響揮發性成分逸出,減少其在頂空瓶上空的濃度,降低萃取效率[21]。故本研究選擇NaCl加入量1.0 mg/L。

圖3 NaCl添加量對益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性成分萃取效果的影響Fig.3 Effect of NaCl addition on extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.1.4 解吸時間選擇

由圖4可知,解析時間在2～4 min時總峰面積及總峰數呈增長趨勢,解析時間在4～5 min時總峰面積及總峰數呈平緩趨勢?？赡苁且驗榻馕鰰r間不足時,萃取頭上尚殘存部分揮發性化合物；解析時間過長時,部分物質可能發生熱分解或聚合反應,降低檢測效率[22-23]。故本研究將解析時間設定為4 min。

圖4 解析時間對益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性成分萃取效果的影響Fig.4 Effect of analytical time on extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.2 較優條件下益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性成分GC-MS分析結果

2.2.1 各類揮發性化合物的對比分析

根據圖5發酵前后總離子流圖及表1分類對比分析各類揮發性化合物。

a-發酵前；b-發酵后圖5 益生菌發酵復合果蔬汁飲料揮發性物質的總離子流Fig.5 Total ion flow diagram of volatile substances in sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.2.2 醇類化合物

復合果蔬汁發酵前檢查出10種醇類物質，總含量12.782%；益生菌發酵后含12種，總含量為18.777%。發酵后比發酵前醇含量明顯增加，其中，已醇5.326%增加至7.326%、苯丙醇1.933%增加至2.439%、反-2-已烯醇1.089%增加至1.434%、1-戊烯-3-醇1.540%增加至2.528%，均具有果香氣味，對益生菌發酵復合果蔬汁飲料風味貢獻較大[24]。發酵之后減少了一種香氣成分異戊醇，其具有令人不愉快的雜醇氣息和辛辣味道[24]；發酵后比發酵前增加了3種醇類物質：α-戊基肉桂醇具有甜的果香、辛香[24]；α-丙基苯乙醇具有水果、清香香氣[24]；苯乙醇具有香甜的玫瑰樣花香[25]等。

2.2.3 有機酸類化合物

復合果蔬汁發酵前檢查出7種有機酸類化合物，總含量為0.622%；發酵后含15種，總含量為13.657%。發酵之后酸類化合物急劇增長是因為乳酸菌發酵產生的代謝物。酸類化合物含量多的且可能香氣成分貢獻較大的有：乳酸(3.209%)具有溫和的令人愉快的酸味；丁酸(2.234%)果香香氣[24]；戊酸(1.523%) 水果香氣[24]；庚酸(0.215%～1.121%) 甜的、蠟香、水果的香氣[24]；甲酸(0.007%～1.234%)尖刺的酸、辣、醋香、果香香氣[24]等。

2.2.4 酯類化合物

復合果蔬汁發酵前檢測出酯類化合物5種，總含量為1.25%；發酵之后含12種，總含量為15.426%。這表明發酵過程中代謝產物及果蔬汁本身酸類化合物與醇類化合物發生某種酯化反應生成大量酯類化合物。酯類化合物含量較多的且可能香氣成分貢獻較大的主要有：戊酸丁酯(0.102%～3.242%)具有甜的、水果、蜜餞、冰淇淋香氣；辛酸乙酯(2.429%)具有類似白蘭地的香味及甜味[26]；異丁酸乙酯(2.201%)具有甜的、水果、黃油、朗姆酒香氣；辛酸異戊酯(1.898%)具有甜的、水果、脂肪、青香香氣；γ-戊內酯(1.507%) 具有水果椰子香氣等。

表1 益生菌發酵復合果蔬汁發酵前后主要揮發性成分及相對含量Table 1 Main volatile components and relative contents of probiotic fermentation sugarcane compound fruit and vegetable beverage before and after fermentation

續表1

編號保留時間/ min揮發性物質相對含量/%發酵前發酵后447.3604-甲基聯苯0.4460.788458.7741-甲基-4-(1-甲基亞乙基) -環己烯-0.2564614.966月桂烯0.4461.0714728.792(E) -7,11-二甲基-3-亞甲基 - 1,6,10-十二碳三烯 0.459-4832.588羅勒烯0.1421.4024933.605金合歡烯 0.3071.5235037.6211,5,5-三甲基-6-亞甲基 - 環庚烷-0.2975138.709六甲基 -環三硅氧烷0.1560.234炔烴5230.0082,3-二氫-3-甲基 -呋喃 0.0220.531醛類533.365己醛 0.0400.6685413.6722-壬烯醛0.0650.4345517.878反-2-已烯醛0.2450.4655623.456肉豆蔻醛0.1940.5565725.4142-乙基丁醛-0.1345828.701正戊醛0.1200.4865930.0972,4-庚二烯醛0.1220.334酚類608.315丁香酚-0.784619.211異丁香酚-0.5626214.3132-甲氧基-4-甲基苯酚-0.2186317.7844-乙基愈創木酚0.2130.5866419.913麥芽酚-0.2876524.311乙基麥芽酚-0.473其他6624.165乙基香蘭素-2.3266731.428異丁基噻唑-1.231

注：“-”代表未檢出。

2.2.5 烴類化合物

復合果蔬汁發酵前檢測出烴類化合物10種，總含量為3.263%；發酵之后含10種，總含量為8.048%。發酵之后烴類化合物急劇增長是因為益生菌發酵產生的代謝物。據文獻報道烴類化合物通常對風味貢獻較大的多為不飽和烴類[27]，所以發酵之后香氣成分貢獻較大的主要有：3,6-辛三烯(0.086%～0.554%)及羅勒烯(0.142%～1.402%)具有甜的、青香、熱帶水果、木香、萜烯香[24]氣；α-松油烯(0.159% ～0.269%)具有果香和木香氣味；d-檸檬烯(0.847%～1.654%)具有甜香、柑橘香、檸檬香；金合歡烯(0.307%～1.523%)具有萜香、青香、草香、藥草香氣味[24]；月桂烯(0.446%～1.071%)具有果香、木香、熱地水果香、木香氣味[24]。

2.2.6 醛類化合物

復合果蔬汁發酵前檢測出醛類化合物6種，總含量為0.812%；發酵之后含7種，總含量為3.61%。相對而言，醛類化合物氣味閾值通常比其同系醇類較低，含量也很低，但對整體的香氣都具有較大的貢獻[28-29]。這7種醛類化合物分別是[24]：己醛(0.040%～0.668%)具有青香、葉香、果香、木香；2-壬烯醛(0.065%～0.434%) 具有脂肪氣息、青香、蠟香、黃瓜香、甜瓜香；反-2-已烯醛(0.245%～0.465%)具有青香、果香、木香、辛香、脂肪香；肉豆蔻醛(0.194%～0.556%)具有脂肪香、蠟香、牛奶香、果香；2-乙基丁醛(0.134%)具有甜香、果香、青香，并帶有可可香韻；正戊醛(0.120%～0.486%)有微辛辣氣息，具果香、面包香；2,4-庚二烯醛(0.122%～0.334%) 具有青香、醛香。

2.2.7 酚類化合物

復合果蔬汁發酵前只檢測出1種酚類化合物，總含量為0.21%；發酵之后含6種，總含量為2.91%。由于益生菌的作用發酵使果蔬汁多酚含量增加，酚類物質主要提高了飲料的陳香、果香、木香香韻。如丁香酚(0.784%)具有強烈的丁香辛香香氣[24]；異丁香酚(0.562%)具有甜辛香、木香及子丁香味道[24]；2-甲氧基-4-甲基苯酚(0.218%)具有辛香、藥香香氣[24]；4-乙基愈創木酚(0.213%～0.586%)天然存在于番茄中，發酵之后香味更加濃郁，具有辛香、藥香、木香及類似丁香香氣[24]；麥芽酚(0.287%)具有甜香、果香、焦糖香氣[24]；乙基麥芽酚(0.473%)具有甜白糖、焦糖、果醬香氣[24]。

2.2.8 其他

復合果蔬汁益生菌發酵前后檢測出乙基香蘭素(2.326%)具有香甜、巧克力氣味[30]；異丁基噻唑(1.231%)具有青香、蔬菜香、草香、番茄香，是原料的主體香[24]。

3 結論

本研究對采用頂空固相微萃取-氣質聯用法分析了甘蔗-番茄-胡蘿卜復合果蔬汁益生菌發酵前后揮發性成分方法做了優化并進行檢測。結果顯示,復合果蔬汁益生菌發酵前后香氣成分發生很大變化,共鑒定出67種揮發性成分。發酵后新產生27種揮發性成分,消失了3種揮發性成分,相對含量也由發酵前的18.938%增加為67.904%。其中醇類化合物、酸類化合物、酯類化合物、烴類化合物、醛類化合物、酚類化合物均有顯著增加,還測定出其他香氣成分包括乙基香蘭素及異丁基噻唑。益生菌發酵改變了復合果蔬汁原本的香氣種類及含量,致使發酵后的復合果蔬風味發生了很大變化,比發酵前甘蔗-番茄-胡蘿卜復合果蔬汁更為醇香、濃郁、獨特,為產品增加感官附加值,可促進消費。此試驗為發酵果蔬風味物質的研究提供了理論基礎,并在產品品控方面發揮一定作用。但本研究還存在局限性,對不同果蔬及發酵果蔬香氣成分仍需進一步深入研究。