滁菊的耐缺氧保護機制依賴HIF-1和TnT

陳容前,湯 雷,汪玉玲,劉均濤,陳 巖,楊如江

(滁州城市職業學院醫學系,安徽滁州 239000)

無論是平原還是高原缺氧暴露人群其患血栓性疾病的風險都是增加的[1-2],缺氧會增強血小板的反應性,促進血小板聚集及血栓形成[3]。近年來,盡管缺氧暴露的人群越來越多,但人們似乎仍缺乏對缺氧相關血栓性疾病風險的防范意識[4],因此,積極干預缺氧暴露風險具有重要的現實意義。目前,抗氧化干預可通過調節應激相關基因而發揮抗缺氧保護作用[5],抗氧化劑的攝入可提高機體缺氧耐受力[6]。滁菊多糖能提高小鼠缺氧耐受力的結果已經被證實,但滁菊多糖的耐缺氧保護作用是否與抗凝有關仍未知[7]。有報道稱,滁菊對血流動力學具有改善功能[8],滁菊總黃酮則對心肌梗死小鼠心臟具有保護作用[9],提示滁菊的耐缺氧保護機制可能涉及抗凝及降低血栓性疾病風險。為驗證這一猜想,本研究將探討滁菊總提取物的耐缺氧保護功能與栓塞性死亡風險之間的關聯性。

缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種缺氧敏感基因,其與機體缺氧耐受潛能有關。有報道稱,生活在高原地區極耐缺氧的拉達克牛,其基因微陣列檢測結果顯示HIF-1是最活躍的上調基因之一,HIF-1及其調節葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和己糖激酶(hexokinase,HK2)在牛的高原耐氧適應中扮演著重要角色[10-11],此外,HIF-1的基因上調對于高原缺氧暴露人群耐受力的提高是至關重要的,HIF-1信號抑制則在高原缺氧、水土不服發病機制中十分關鍵[12]。

脂蛋白a(lipoprotein a,Lp-a)是一種富含膽固醇的LDL樣顆粒,其與缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成和中風風險增加顯著相關[13]。流行病學和遺傳學研究已確定,血清Lp-a水平升高是心血管疾病的一個獨立危險因素,Lp-a可能通過促動脈粥樣硬化和血栓形成機制來增加心血管疾病風險[14]。為降低血栓形成及心血管疾病的風險,Lp-a靶向療法應運而生[15]。

肌鈣蛋白是心肌損傷的高度敏感的生物標志物,其水平升高被認為是心肌梗塞診斷的基石[16]。血清肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)是心臟病患者全因和心血管死亡率的良好預測因子,同時也是急性缺血中風死亡率的強預測因子[17]。

本研究將基于耐缺氧實驗法建立小鼠氧氣剝奪模型,考察滁菊干預對各風險因素的影響,以明確滁菊在提高缺氧耐受及預防缺氧誘導的栓塞性疾病風險的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性ICR小鼠(20±2) g 南京市江寧區動物繁殖場;飼料及墊料 江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司;鈉石灰 東莞永勝宏基醫療器械有限公司;無水乙醇(分析純) 天津市永大化學試劑有限公司;滁菊 安徽菊泰滁菊草本科技有限公司;2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH,D9132-5G) Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;parafilm封口膜 上海碧云天生物技術有限公司;小鼠肌鈣蛋白T(TnT)Elisa試劑盒、小鼠脂蛋白a(Lp-a)Elisa試劑盒、小鼠缺氧誘導因子-1(HIF-1)Elisa試劑盒 南京金益柏生物科技有限公司。

BSM-220.4型電子分析天平 上海卓精電子科技有限公司;DYQC型醫用超聲波清洗器 連云港歐倍潔醫療設備有限公司;帝肯sunrise梯度濾光片光吸收酶標儀 帝肯上海貿易有限公司;SHB-3A循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠;離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 金壇區西城新瑞儀器廠;砂芯過濾裝置 鹽城市鈺楊玻璃儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 滁菊溶液制備 稱取1 g滁菊放入100 mL試管中,倒入70%乙醇40 mL,封口膜封好試管口后置于試管架上,放入超聲波清洗器,功率設為192 W、溫度為60 ℃,超聲波提取10 min,提取液抽濾后將得到的濾液倒入蒸發皿,隨后置于通風櫥柜中的水浴鍋上70 ℃蒸發得到提取物。純凈水溶解后于50 mL容量瓶定容制得實驗用提取液備用。采用DPPH自由基清除法[18]檢測提取物的抗氧化活力以控制每次提取液質量,DPPH自由基清除率控制在87%。

1.2.2 滁菊對小鼠缺氧暴露的干預 將18只ICR雄性小鼠隨機分成2組,缺氧組和滁菊組,每組9只。缺氧組給予0.4 mL純凈水灌胃;滁菊組給予0.4 mL滁菊提取液(濃度為87%的DPPH自由基清除率)灌胃。預處理1 h后,將所有小鼠分別放入盛有200 g鈉石灰的500 mL廣口瓶中,蓋實瓶蓋后用封口膜密封缺氧處理30 min后使小鼠迅速脫離缺氧環境,第2 d、第3 d再重復兩次,末次缺氧30 min后將小鼠取出,迅速眼球摘除法取血。具體實驗流程見圖1。

圖1 滁菊干預缺氧暴露小鼠流程Fig.1 Protocol of pretreatment with Chuju in mice exposed to hypoxia

1.2.3 耐受鼠及敏感模型鼠建立 實驗動物適應飼養一周后按體重隨機分組,動物飼養環境為:溫度(21±2) ℃,濕度(30%～70%),光照周期12 h/12 h,動物自由采食和飲水。實驗期間,將選定的18只ICR雄性小鼠直接置于盛有鈉石灰的廣口瓶中,封口后立即記時,直至小鼠出現缺氧抽搐癥狀,迅速取出小鼠使其脫離缺氧環境,并記錄每只小鼠的抽搐時間。根據抽搐時間,將小鼠分成缺氧敏感組(30 min以下)、中度敏感組(30～40 min)、耐受組(40 min以上)。其中,缺氧敏感組及耐受組小鼠在初次缺氧暴露后24 h、48 h再進行缺氧暴露2次,每次持續時間為25 min,末次缺氧后將所有小鼠取出眼球摘除法采血備用。

1.2.4 Elisa法檢測血清HIF-1、Lp-a及TnT的含量

1.2.4.1 血清的制備 眼球摘除法采血后,置于10 mL離心管中,室溫血液自然凝固10～20 min后,離心機3000 r/min下離心20 min。仔細收集上清置于EP管中并標簽后,-20 ℃保存備用。保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

1.2.4.2 Elisa法實驗操作 按小鼠HIF-1、Lp-a及TnT Elisa分析(enzyme linked immunoassay)試劑盒說明書進行實驗操作,酶標儀450 nm波長下測定各孔的吸光度(OD值),根據標準曲線的回歸方程及樣本的OD值計算各樣品的實際濃度。

1.3 統計處理

統計結果均采用平均數±標準差(±SD)來表示,運用SPSS 22.0 for windows軟件進行One-way ANOVA:LSD-t檢驗進行組間差異比較,以p<0.05判定有無統計學差異。所有作圖均由Origin 8.0軟件實現。

2 結果與分析

2.1 HIF-1、Lp-a及TnT標準曲線的繪制

以標準品的OD值為橫坐標(X),濃度為縱坐標(Y),進行曲線擬合。標準曲線的回歸方程見圖2,各回歸方程的R2均在0.98以上,表明OD值與各指標濃度間存在顯著的線性關系,即標準曲線擬合結果可靠。

圖2 HIF-1、Lp-a及TnT標準曲線Fig.2 Standard curve of HIF-1,Lp-a and TnT

2.2 滁菊干預對缺氧鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT的影響

耐缺氧動物實驗已經證實滁菊可提高小鼠的缺氧耐受力[7],而HIF-1為缺氧耐受因子,為明確滁菊活性成分是否通過HIF-1提高缺氧鼠的缺氧耐受力,圖3A顯示了滁菊干預對缺氧小鼠血清HIF-1表達水平的影響。與單獨缺氧暴露小鼠相比,缺氧前給予滁菊干預能極顯著地提高HIF-1的表達水平(p<0.01),表明滁菊可促進缺氧狀態下小鼠HIF-1的表達。

Lp-a及TnT是血栓性疾病的風險因子,為明確滁菊是否可抑制缺氧誘導的血栓性疾病風險,圖3B、3C比較了缺氧暴露小鼠與滁菊干預小鼠之間血清Lp-a、TnT表達水平的差異。滁菊干預能顯著地抑制缺氧鼠Lp-a及TnT的表達(p<0.05),表明滁菊可抑制缺氧誘導的血栓性疾病風險因子的表達。

圖3 滁菊干預對缺氧暴露小鼠血清 HIF-1、Lp-a、TnT的影響(n=3)Fig.3 Effect of Chuju intervention on serum HIF-1,Lp-a, TnT in mice exposed to hypoxia(n=3)注:*代表差異顯著,p<0.05;**代表 差異極顯著,p<0.01,圖4同。

2.3 缺氧耐受小鼠及缺氧敏感小鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT表達差異

為明確滁菊對缺氧鼠HIF-1的上調是否發揮了抗缺氧保護功效,圖4A比較了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中HIF-1表達水平差異。與缺氧敏感組小鼠相比,缺氧耐受組小鼠血清中缺氧誘導因子(HIF)顯著增加(p<0.05),這與缺氧耐受動物HIF-1水平升高結果一致[9]。表明血清HIF-1表達水平升高有助于促進小鼠的缺氧耐受力,HIF-1上調介導了滁菊的耐缺氧保護機制。

為明確滁菊對缺氧誘導的血栓性疾病風險因子表達抑制是否參與了其抗缺氧保護機制,圖4B、4C比較了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中Lp-a、TnT表達水平的差異。與缺氧敏感組小鼠相比,缺氧耐受組小鼠血清中Lp-a雖無統計學差異(p>0.05),但TnT表達水平則極顯著降低(p<0.01),表明TnT為缺氧敏感因子,其表達下調有利于提高缺氧耐受力。因此,TnT的表達抑制參與了滁菊的耐缺氧保護機制。

圖4 缺氧耐受組、敏感組小鼠血清中 HIF-1、Lp-a、TnT水平差異(n=3)Fig.4 Differences in serum levels of HIF-1, Lp-a,TnT between hypoxia-tolerant group and sensitive group(n=3)

3 討論

HIF-1是一種缺氧應答因子,其本質為轉錄因子,其表達可啟動下游一系列抗氧化應激因子的表達,從而促進缺氧適應[11,19]。圖3A結果顯示,與缺氧對照組相比,滁菊干預能極顯著促進HIF-1的表達(p<0.01),提示HIF-1可能參與了滁菊的缺氧保護機制。與缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠的血清HIF-1水平顯著增加(p<0.05)(圖4A),這與缺氧耐受動物HIF-1水平升高的報道結果一致[10],說明HIF-1有利于缺氧動物耐受力的提高,滁菊可通過促進HIF-1表達而提高小鼠缺氧耐受力,即HIF-1的上調介導了滁菊的耐缺氧保護機制。

高原缺氧暴露人群中風的風險是增加的,尤其是缺血性中風最常見[2],隨著高原缺氧暴露人群越來越多,研究高原中風風險具有十分重要的意義。臨床研究表明,血清Lp-a水平升高是腦中風獨立的死亡風險因子,Lp-a是心血管疾病的重要靶點[15]。滁菊干預能顯著抑制缺氧導致的Lp-a水平的升高(p<0.05)(圖3B),然而,通過比較缺氧耐受鼠與缺氧敏感鼠之間Lp-a水平差異并未發現有統計學意義(p>0.05)(圖4B)。以上結果表明,小鼠無法通過自身潛能抑制Lp-a的表達,即缺氧累積損傷超出了小鼠自身的生理調節能力,而滁菊干預提供了外源性保護作用。此外,發現Lp-a在缺氧耐受或缺氧敏感鼠中的表達水平極顯著地高于缺氧組,這可能是因為前兩組的缺氧模式風險更大,提示選擇Lp-a作為缺氧死亡風險的評價指標是合理的。

TnT 是缺血性中風病人另一獨立的死亡風險因子[17]。與缺氧對照組相比,滁菊預處理能顯著抑制缺氧誘導的TnT表達(p<0.05)(圖3C),說明滁菊在預防缺氧相關血栓性疾病風險上具有一定的潛力。與缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠血清中TnT水平明顯減少(圖4C),表明TnT表達阻抑對提高小鼠的缺氧耐受力是有利的,滁菊對TnT的下調參與了滁菊的耐缺氧保護機制。

綜上所述,在預測缺氧相關死亡及血栓性疾病發生風險方面,TnT是比Lp-a更敏感的預測因子。TnT及HIF-1共同參與了滁菊的耐缺氧保護機制,即滁菊具有提高小鼠缺氧耐受及預防缺氧相關血栓性疾病風險的雙重保護作用,這將為滁菊用以預防高原缺氧導致的繼發性疾病提供理論依據。