釀造酒中非釀酒酵母的研究進展

卜光明,周化斌,周茂洪,楊海龍,*

(1.浙江瑞邦藥業股份有限公司,浙江溫州 325000;2.溫州大學生命與環境科學學院,浙江溫州 325035)

在人類歷史進程中,酒類飲品在經濟和文化等方面發揮著獨特而重要的作用,考古證據表明最古老的釀造酒出現在公元前7000年的中國[1],是多種微生物共同作用的產物,其中最主要的是酵母菌,它通過代謝水果、谷物、蜂蜜和其它原料中的糖產生酒精。酒精發酵以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為主,但許多非釀酒酵母(non-Saccharomyces)也參與其中,不但將糖轉化成為酒精和二氧化碳,并通過其他一系列復雜的生化反應生成甘油、雜醇、醛類及酯類等物質。釀造酒的風味受原料來源與品質、釀造工藝、陳釀條件等多種因素影響,非釀酒酵母的代謝能改善酒體的口感、風味及香氣,賦予釀造酒地域特色。

1987年Heard等[2]首次研究報道了釀酒過程中出現的克勒克酵母(Kloeckera)、假絲酵母(Candida)、漢生酵母(Hansenula)以及有孢漢生酵母(Hanseniaspora)等非釀酒酵母菌株,此后非釀酒酵母的研究成為釀酒領域的熱點之一。本文對近十幾年來釀造酒中非釀酒酵母的研究方法、生長條件及其在釀造中的作用進行綜述,并分析了存在的問題,以期為非釀酒酵母優良菌株的開發利用提供參考。

1 非釀酒酵母種類分析及群落多樣性的研究方法

傳統的微生物研究是將菌株分離純化,然后進行形態、生理生化及分子生物學分析。但是大多數非釀酒酵母對酒精敏感,只存在于發酵的早期階段,隨著發酵的進行,非釀酒酵母在幾個小時內就會逐漸被釀酒酵母所取代[3],所以傳統的純培養方法只能顯現少數非釀酒酵母的信息,不能充分反映酵母群落的多樣性,導致一些具有應用價值的酵母信息被遺漏。近年來,隨著分子生物學的發展,基于聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的非培養分析技術在酵母多樣性和群落分布研究中不斷應用,如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構象多態性、限制性片段長度多樣性(RFLP)、核糖體間隔基因自動分析(ARISA)、宏基因組學、熒光原位雜交(FISH)、熒光定量PCR、焦磷酸測序(Pyrosequencing)、串聯重復序列(Tandem repeat)分析等,不但可以直接確定不同樣品中酵母的種類及其豐度,并且可以建立可靠的酵母群系指紋圖譜,確定酵母群系在時間和空間上的變化規律[4]。

聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)是常用技術之一,Romancino等[5]采用PCR-RFLP技術分析了意大利Sicily地區葡萄汁中的非釀酒酵母,確定了分屬假絲酵母、有孢漢生酵母、伊薩酵母(Issatchenkia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、梅氏酵母(Metschnikowia)、有孢園酵母(Torulaspora)的10個種;Ubeda等[6]亦以PCR-RFLP技術確定西班牙La Mancha地區釀酒廠的非釀酒酵母分屬有孢園酵母、假絲酵母、接合酵母(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母(Pichia)、有孢漢生酵母、克魯維酵母、緒方酵母(Ogataea)和路德類酵母(Saccharomycodes);Lv等[4,7]通過PCR-RFLP指紋圖譜對福建紅曲黃酒釀造用酒曲中的酵母菌進行分型,確定含有季也蒙畢赤酵母(P.guilliermondii)、扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、弗比恩畢赤酵母(P.fabianii)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、核桃隱球酵母(Cryptococcusheveanensis)、淺白隱球酵母(Cry.albidus)、馬朗復膜孢酵母(Saccharomycopsismalanga)、尼蘭擲孢酵母(Sporobolomycesnylandii)、異常維克氏酵母(Wickerhamomycesanomalus)、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、粘性紅圓酵母等非釀酒酵母菌;David等[8]應用焦磷酸測序技術和PCR-ITS-RFLP檢測技術研究了釀酒過程中酵母菌的多樣性及酵母群動態分布。

串聯重復序列(Tandem repeat)廣泛存在于真核生物和一些原核生物的基因組中,并表現出種屬、堿基組成等的特異性。串聯重復序列分析可應用于微生物菌株鑒別、基因分型等方面。絕大多數非釀酒酵母的基因組序列未知,串聯重復序列-tRNA結合了基于串聯重復的不同寡核苷酸和基于保守的tRNA區域的第二寡核苷酸,可用于菌株多樣性分析。Barquet等采用PCR分析非釀酒酵母的串聯重復序列-tRNA,成功地確定了美極梅氏酵母(M.pulcherrima)、維尼有孢漢生酵母(H.vineae)、葡萄有孢漢生酵母(H.uvarum)、仙人掌有孢漢遜酵母(H.opuntiae)、澤蘭假絲酵母(C.zemplinina)的菌株多樣性[9]。

另外,為了實時監測酵母培養過程中的狀況,研究人員開發了基于紅外輻射吸收的分析技術非破壞性分析方法,根據細胞的不同成分的傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)來鑒定分離物。FT-IR技術能夠鑒定葡萄汁中的大部分非釀酒酵母種類,分析其多樣性,具有操作簡便、不破壞細胞結構的特點,是研究釀造酒中非釀酒酵母的新技術[10]。

2 非釀酒酵母及影響其生長的因素

過去,非釀酒酵母菌往往被忽略或被認為是不受歡迎的腐敗酵母菌,隨著對釀酒微生物的深入研究,發現在釀酒酵母的基礎上添加適當的非釀酒酵母菌株,可以釀造出風格獨特、類型多樣的產品。傳統紹興黃酒的發酵醪中,酵母種類極為豐富,紹興黃酒麥曲中含有畢赤酵母屬、紅酵母屬、鎖擲酵母屬的非釀酒酵母[11]。毛青鐘[12]對傳統工藝生產的元紅酒、加飯酒和善釀酒的發酵醪中和淋飯酒母中酵母的分離,獲得55株酵母菌,這些菌在黃酒釀造過程中呈動態變化,發酵初期,60%為釀酒酵母,35%為果酒和葡萄酒酵母,5%為其他酵母,而發酵后期低耐酒精度的酵母死亡并自溶,分解成各種氨基酸、核酸和維生素等營養物質和多種風味物質;目前從不同地區的葡萄酒[5,6,13-15]、黃酒[11-12]、蘋果酒[17]、龍舌蘭酒[18]等產品釀造相關分離物中獲得了酒香酵母(Brettanomyces)、假絲酵母、棒孢酵母(Clavispora)、隱球酵母(Cryptococcus)、有孢漢生酵母、漢生酵母、伊薩酵母、克魯維酵母、克勒克酵母、克里格范瑞吉酵母(Kregervanrija)、拉錢氏酵母(Lachancea)、洛德酵母(Lodderomyces)、梅氏酵母、邁耶氏酵母(Meyerozyma)、米勒氏酵母(Millerozyma)、緒方酵母、畢赤酵母、普來氏酵母(Priceomyces)、紅酵母(Rhodotorula)、路德類酵母、復膜孢酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、擲孢酵母、世達梅樂酵母(Starmerella)、有孢園酵母、威克氏酵母、接合酵母等非釀酒酵母菌屬中的菌株,其中以季也蒙有孢漢遜酵母(H.guilliermondii)、異常威克氏酵母(W.anomalus)、德布爾有孢酵母(T.delbrueckii)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)最為常見。不同地區的非釀酒酵母存在差異,意大利Sicily地區葡萄汁中的非釀酒酵母主要有星狀假絲酵母(C.stellata)、季也蒙有孢漢遜酵母、奧斯曼有孢漢遜酵母(H.osmophila)、葡萄有孢漢生酵母、陸生伊薩酵母(I.terricola)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、美極梅氏酵母、德布爾有孢酵母、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)等[5];而意大利Apulian地區除季也蒙有孢漢遜酵母、葡萄有孢漢生酵母、陸生伊薩酵母、拜氏接合酵母,還檢測到博伊丁假絲酵母(C.boidinii)、澤蘭假絲酵母、仙人掌有孢漢遜酵母等種類[19];寧夏賀蘭山東麓葡萄種植園土樣和葡萄果實表面上附著的非釀酒酵母以德布爾有孢酵母、葡萄有孢漢生酵母、異常漢生酵母(Hansenulaanomala)和東方伊薩酵母(I.orientalis)為主[20]。

非釀酒酵母中有些種類有助于葡萄酒的發酵、增加口感與芳香風味,而有些種類會導致發酵延遲、并可能產生不良風味。在葡萄汁中充入飽和CO2可以抑制不利菌株桿狀世達梅樂酵母(Starmerellabacillaris)與葡萄有孢漢生酵母的生長,促進有益菌株德布爾有孢酵母與克魯維畢赤酵母(P.kluyveri)的增殖[14]。Shekhawat等[21]研究表明氧含量對非釀酒酵母的生長影響顯著,德布爾有孢酵母和普爾切梅氏酵母可在微氧條件增殖,而耐熱拉錢氏酵母(L.thermotolerans)的增殖基本無需氧的參與。

葡萄汁中的氮源對酵母的生長代謝影響極大,氮源限制可增加非釀酒酵母的豐度[22],不同氨基酸影響非釀酒酵母的生長,桿狀世達梅樂酵母最適氨基酸為丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、賴氨酸,美極梅氏酵母最適氨基酸為丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸,而膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)最易于吸收的氨基酸為半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸和蘇氨酸[23];氮源限制及提高芳香氨基酸的濃度可顯著促進葡萄有孢漢生酵母Hv4菌株、桿狀世達梅樂酵母Cz4菌株、普爾切梅氏酵母Mpp菌株和德布爾有孢酵母Tdp菌株合成芳香醇,但低濃度的葡萄糖會減少芳香醇的合成[24]。

3 非釀酒酵母在釀酒中的作用

3.1 降低乙醇含量

基于健康的考慮,消費者日益趨向于選擇低酒精度的釀造酒。采用精餾、蒸發、反滲透等物理方法可以去除釀造酒中的部分乙醇,但會導致風味的劣化。布魯德氏酵母(DekkerabruxellensisAWRI1127)、季也蒙梅氏酵母(M.guilliermondii)、霍氏畢赤酵母(P.holstii)、膜璞畢赤酵母、異色畢赤酵母(P.anomala)、紅擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)等非釀酒酵母不產乙醇,星狀假絲酵母、異色德氏(D.anomala)、法爾皮有孢漢生酵母(H.valbyensis)、發酵畢赤酵母(P.fermentans)產乙醇能力較釀酒酵母弱得多[25],可用于低醇產品的釀造。Hu等[26]采用有孢漢生酵母(H.uvarum、H.opuntiae、H.occidentalis)、庫德里亞畢赤酵母(P.kudriavzevii)和德布爾有孢酵母釀造橘子酒,與釀酒酵母相比,酵母增殖數量低(7.8～8.0lg cfu/mL)、酒精度低(4.13%～7.79%);德布爾有孢酵母只能利用麥芽汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖,而不能分解麥芽糖、麥芽三糖,可用于釀造乙醇濃度低至 0.9%(v/v)的啤酒產品[27]。

3.2 產酶能力

非釀酒酵母可分泌酯酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、果膠酶、果糖基轉移酶、木聚糖酶、淀粉酶等酶類[13,32-33],在釀造過程中可以提高原料的利用率,水解糖苷類成分釋放出芳香化合物增加酒的風味。葡萄有孢漢生酵母分泌的糖苷酶可水解芳香糖苷類,釋放萜烯類成分,提高葡萄酒的花香、甜香、漿果和堅果的香氣[28];美極梅氏酵母分泌α-阿拉伯呋喃糖苷酶合成萜烯和硫醇類芳香化合物,提高風味[29];李婷等[30]從川南白酒窖池中分離1株高產酯酶的發酵畢赤酵母菌株,具有較高的C4～C8酯酶活性,可用于葡萄酒釀造的增香;毛青鐘等[31]研究表明,黃酒酒藥和淋飯酒母中大量存在的復膜孢酵母可產α-淀粉酶,能分解生料和熟料淀粉,也能產生糖化酶,分解淀粉為葡萄糖,提高黃酒釀造的原料利用率。研究報道產果膠酶的菌株包括假絲酵母(C.stellata)、畢赤酵母(P.kudriavzevii)、維克氏酵母(W.anomalus)[13];假絲酵母(C.sakeBCS403)菌株可產木聚糖酶[34];有孢漢生酵母(H.uvarum、H.vineaeHv3)、梅氏酵母(M.pulcherrima)、畢赤酵母(P.membranifaciens)、維克氏酵母(W.anomalus)能產β-木糖苷酶[32,35];具有分泌β-葡萄糖苷酶能力的菌株最多,包括假絲酵母(C.sakeBCS403)、有孢漢生酵母(H.uvarumHu8、H.guilliermondii)、拉錢氏酵母(L.thermotolerans)、梅氏酵母(M.pulcherrima)、畢赤酵母(P.anomala、P.membranifaciensPm7)、紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)以及維克氏酵母(W.anomalusWa1)等[13,28,36]。

3.3 產生風味物質

非釀酒酵母改善酒的風味一是分泌酶降解糖苷鍵釋放芳香化合物,二是通過自身代謝直接合成或調整風味成分,非釀酒酵母合成的主要風味成分見表1。德布爾有孢酵母可減少乙醇和乙酸的形成,增加琥珀酸、乳酸和高級醇的含量;釀酒復膜孢酵母(Saccharomycopsispombe)可代謝幾乎所有的蘋果酸,產生更多的甘油、乙醛和丙酮酸[37];Whitener等[38]研究表明,與釀酒酵母相比,耐熱拉錢氏酵母增加2-苯乙醇和丙酸苯乙酯的含量,美極梅氏酵母可產生更多的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚,德布爾有孢酵母可增加丙酸苯乙酯的含量;卡利比克畢赤酵母(P.caribbicaUFLA CAF733)發酵可提高2-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等揮發性成分的含量[39];美極梅氏酵母有助于增加葡萄酒中是酯類、高級醇和萜烯類的含量,提高了美樂低醇桃紅葡萄酒香氣品質[40];原苗苗等[41]比較了不同非釀酒酵母產香差異,結果表明美極梅氏酵母產生的發酵香氣濃度最高(206.27 mg/L),其中有玫瑰花香的苯乙醇以及3-甲基丁醇對香氣的貢獻最大,淺白隱球酵母產生的金合歡醇能給葡萄酒帶來柔和的甜香氣,葡萄有孢漢遜酵母能夠產生較為豐富的香氣物質,典型的發酵香氣為乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇,賦予葡萄酒復雜的果香和花香;德布爾有孢酵母可形成乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙醛等風味成分,從而使啤酒具有果香味[27]。劉景等[42]分離獲得的平常假絲酵母(C.inconspicua)T2 菌株發酵蘋果汁可產生乙酸苯乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙醇等風味成分,可以顯著改善蘋果汁發酵風味,適于生產低醇蘋果汁飲料。

表1 非釀酒酵母在改善酒體風味中的作用Table 1 The role of non-Saccharomyces in improving wine flavor

乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯和乙酸-2-苯乙酯是由酵母在后續發酵過程中通過酯合成途徑合成。陳玉香等[43]對比不同釀酒酵母產酯能力,結果表明扣囊復膜孢酵母Y1菌株相對較弱,淺白隱孢酵母Y19菌株具有很強的產辛酸乙酯的能力,賦予黃酒玫瑰、橙子的花果香。

在傳統起泡酒釀造工藝中,二次發酵時采用路德類酵母(Saccharomycodesludwigii)和釀酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)代替釀酒酵母,不但可以完成起泡酒的釀造,而且風味、口感俱佳,紅色起泡酒中含有更多的花青素,色度更強[44];González-Royo等[45]在葡萄汁中先接入德布爾有孢酵母或者美極梅氏酵母發酵24～36 h,然后再接入釀酒酵母進行酒精發酵,德布爾有孢酵母可以增加甘油的形成,減少揮發性酸的產生,同時可增加產品的起泡性和泡持性;美極梅氏酵母可增加產品的泡持性,并提高其煙熏味及花香味。

3.4 非釀酒酵母與釀酒酵母相互作用釀造高品質產品

非釀酒酵母與釀酒酵母共同參與酒精發酵,但釀酒酵母的代謝產物會抑制非釀酒酵母的生長,而不同的菌株在發酵中存在的時間各異,美極梅氏酵母MJS22菌株與釀酒酵母間存在強烈的拮抗作用,導致美極梅氏酵母MJS22過早死亡,但釀酒酵母對德布爾有孢酵母Alpha菌株的生長幾乎無抑制作用[49]。桿狀世達梅樂酵母(Starmerellabacillaris)、德布爾有孢酵母(T.delbrueckii)在混合發酵中的存在時間較葡萄有孢漢生酵母(H.uvarum)和美極梅氏酵母(M.pulcherrima)要長[50];維尼有孢漢生酵母(H.vineae)、葡萄有孢漢生酵母、美極梅氏酵母、桿狀世達梅樂酵母、德布爾有孢酵母CECT13135在葡萄酒釀造過程中會與釀酒酵母競爭營養,從而導致發酵遲緩或停止,添加磷酸二銨和復合維生素可以有效地防止發酵遲緩的發生[51]。非釀酒酵母對釀酒酵母的生長代謝具有促進作用,Curiel等[52]采用轉錄組分析研究了厭氧條件下德布爾有孢酵母對釀酒酵母生長代謝的影響,確定可以促使與細胞增殖和糖代謝相關基因的過量表達,而有氧條件下葡萄有孢漢生酵母和清酒假絲酵母可促進釀酒酵母葡萄糖和氮代謝。

發酵過程中非釀酒酵母的生長代謝可以提高原料的利用率、合成風味成分增加酒體的芳香,但釀酒酵母仍是發酵過程不可或缺的組分,研究人員將不同的非釀酒酵母與釀酒酵母進行組合,達到抑制其不良作用,發揮優良功能的目的。Lleixà等[22]確定在非釀酒酵母與釀酒酵母順序發酵葡萄酒工藝中,接種釀酒酵母的最佳時間是發酵前48 h,這樣可以保證營養不被非釀酒酵母過度消耗,但如在前24 h接種釀酒酵母會顯著減少釀造過程中非釀酒酵母的豐度;分別采用耐熱拉錢氏酵母(L.thermotolerans,LT)、需氧哈薩克酵母(Kazachstaniaaerobia,KA)、克魯維畢赤酵母(P.kluyveri,PK)、美極梅氏酵母(M.pulcherrima,MP)接入葡萄汁發酵至酒精度為2%,然后接入釀酒酵母(SC)完成酒精發酵,與純釀酒酵母發酵相比,LT-SC 發酵形成不同種類的酯類、醇和萜類,其中KA-SC組合形成大量的揮發性酸,PK-SC組合形成較多的乙醛,MP-SC組合形成較高濃度的酯類[53];10%釀酒酵母和90%的德巴利酵母(Debaryomycesvanrijiae)混合接入葡萄汁可形成高濃度的萜烯和高級醇,1%釀酒酵母和99%的C.sake混合可合成大量酯類和脂肪酸[34];將有孢漢生酵母(H.osmophilaHa32)、畢赤酵母(P.anomalaPi9)、路德類酵母(SaccharomycodesludwigiiSd64)、接合酵母(ZygosaccharomycesflorentinusZy424)與釀酒酵母混合發酵葡萄汁,可以提高產品中多糖的含量,改善乙酸以及乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和2-甲基-1-丁醇等揮發性成分的濃度[54];釀酒酵母與克魯維畢赤酵母、耐熱拉錢氏酵母或者美極梅氏酵母順序接種發酵葡萄酒可以改善丙酮酸、甘油、乙醛、高級醇、乙酸酯、乙酸苯乙酯和萜類的含量[55]。李藝凡等[56]將從紅茶菌液中分離得到的克魯斯假絲酵母(C.cruseiH8)菌株與全美梅氏酵母、葡萄有孢漢生酵母按1∶1∶1的比例混合,經過46 h 培養后,與釀酒酵母順序接種發酵赤霞珠紅葡萄酒,可形成大量的苯乙醇、薄荷醇、檸檬烯、十一醛、肉豆蔻醛等風味物質,豐富酒體的特征相香氣成分。

在其它果酒發酵方面,釀酒酵母與美極梅氏酵母JS22菌株組合顯著提高櫻桃酒中高級醇、乙酸酯、萜烯類成分的含量,釀酒酵母與德布爾有孢酵母Alpha菌株組合可提升櫻桃酒的果香味,減少青澀味[49];劇檸等[57]將分離獲得的有孢漢遜酵母葡萄有孢漢生酵母GF-60菌株與商用釀酒酵母以3∶1比例混合發酵枸杞果酒,經GC-MS 測定分析,與釀酒酵母單獨發酵相比,混種發酵提高了辛酸乙酯、癸酸乙酯、4-羥基-2-丁酮等的香氣成分含量;Nuez-Guerrero等[18]從龍舌蘭汁中分離獲得了非釀酒酵母菌株德布爾有孢酵母ITD-00014a,25%的德布爾有孢酵母ITD-00014a與75%的釀酒酵母菌株ITD-00185混合發酵,釀造的龍舌蘭酒產率高、富含酯類、萜類揮發性成分。

4 展望

釀酒過程中,酵母對釀造酒風味質量具有重要影響,不同的非釀酒酵母產生的不同代謝產物可賦予酒體獨特的口感和香氣。目前,國內外大部分釀造酒的生產采用商業釀酒酵母,難于突出產品的特點,選擇性能優良的非釀酒酵母菌株提高釀造酒的品質已經成為當前研究的主要方向。有關非釀酒酵母的研究主要集中于葡萄酒釀造,并且將非釀酒酵母與釀酒酵母結合發酵葡萄酒的工作仍處于實驗室或中試階段,同時對于黃酒、啤酒及其它特色果酒釀造中非釀酒酵母的作用認識非常有限,因此,在特色非釀酒酵母菌株的篩選、改造及工業化應用方面需要進一步深入研究,以釀造出口感飽滿、風格獨特的產品。另外,部分非釀酒酵母具有良好的益生活性[58],但目前缺乏詳細、深入的研究,篩選活性優良的菌株,并將其與酒的釀造相結合,以釀造具有保健功效的產品是非釀酒酵母研究的另一重要方向。