響應面優化超聲輔助VC/H2O2山楂果膠改性研究

朱毅偉,陳曉雯,趙立偉,朱傳合*

響應面優化超聲輔助VC/H2O2山楂果膠改性研究

朱毅偉1,陳曉雯1,趙立偉2,朱傳合1*

1. 山東農業大學食品科學和工程學院, 山東 泰安 271018 2. 江蘇派樂滋食品有限公司, 江蘇 徐州 221000

果膠是一種酸性多糖，被廣泛應用于食品行業及其它行業。果膠的生物活性與其分子量和結構密切相關。本研究以實驗室自制山楂果膠為原料，采用超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠，以固有粘度和還原糖含量為指標，采用單因素實驗和響應面實驗進行改性工藝優化。結果表明，最佳工藝參數為：H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數207次、超聲振幅31%，在此條件下，果膠的還原糖含量為52.22±0.68%，與預測值基本一致，說明該模型具有可靠性。

山楂果膠; 改性; 超聲輔助VC/H2O2

果膠是一種存在于植物初生細胞壁和胞間層的大分子多糖[1]，因其具有凝膠、增稠、乳化等功能性質被廣泛應用于食品行業，另外，果膠還可以用于保健食品和藥品[2]。山楂中的果膠含量達6.4%，居所有水果之首[3]。研究顯示，山楂果膠及其寡糖具有抑制光氧化損傷、抗氧化、抑菌等作用[4-6]。

果膠的生物活性與其分子量密切相關，在一定的分子量范圍內，分子量越低，果膠的生物活性越高[7,8]。實驗室前期制備得到的山楂果膠其分子量大、粘度高、水溶性差，限制了其生物活性的發揮。因此，選擇適宜的改性方法可以降低果膠的分子量、改善其水溶性，從而具有更好的生物活性[9]。然而，改性果膠的研究主要集中在柑橘果膠方面[2,9]，對山楂果膠改性方面的研究報道較少。目前，果膠改性的方法主要包括酸/堿法、氧化法、酶法和超聲等物理改性法[10]。在改性過程中，可以將多種改性方法聯合使用，如超聲輔助VC/H2O2改性，H2O2在酸性環境中，可以產生高活性的羥自由基（·OH），促進多糖氧化降解，另外，Fe2+、VC等可以作為催化劑，提高反應速率[11]。超聲波對VC/H2O2改性具有協同作用，其空化效應能夠引起果膠多糖等大分子物質的化學鍵斷裂、自由基氧化等反應[12]，可以提高反應速率，降低反應時間以及H2O2用量。因此，本研究在單因素實驗的基礎上，設計響應面實驗，優化超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂果膠（實驗室自提）；VC、30% H2O2、亞硫酸氫鈉、DNS、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

PB153-S分析天平，METTLER TOLEDO；HH-6數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；N-1300旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機，德國CHRIST。

1.3 實驗方法

1.3.1超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的工藝優化向山楂果膠中加入一定量的H2O2和VC，用去離子水定容，配成濃度為0.5%的山楂果膠溶液，取10 mL果膠溶液進行超聲處理，超聲波頻率為20 kHz，探頭直徑6 mm，探頭沒入液面下1 cm，脈沖時間為3 s，間隔5 s。溫度為30 ℃，改變超聲次數（脈沖次數）和超聲振幅。加入NaHSO3溶液（0.2 mol/L）終止反應，離心，濃縮，凍干，備用。

1.3.1.1 H2O2濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、VC濃度10 mmol/L、超聲次數100次、超聲振幅30%的條件下，研究H2O2濃度0、20、40、60、80、100 mmol/L對果膠固有粘度和還原糖含量的影響。

1.3.1.2 VC濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、H2O2濃度60 mmol/L、超聲次數100次、超聲振幅30%、VC濃度0、5、10、15、20、25 mmol/L的條件下處理果膠，測定其固有粘度和還原糖含量。

1.3.1.3 超聲次數對果膠固有粘度和還原糖含量的影響在溫度30 ℃、H2O2濃度60 mmol/L、VC濃度20 mmol/L、超聲振幅30%、超聲次數10、20、40、100、200、300次的條件下，以果膠固有粘度和還原糖含量為評價指標，確定最佳條件。

1.3.1.4 超聲振幅對果膠固有粘度和還原糖含量的影響在H2O2濃度60 mmol/L、VC濃度20 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數200次的條件下，研究超聲振幅0、20、30、40、50%對果膠固有粘度和還原糖含量的影響。

1.3.1.5 響應面優化在單因素實驗結果的基礎上，以還原糖含量作為評價指標，選取H2O2濃度、VC濃度、超聲次數和超聲振幅四個因素設計Box-Behnken實驗，其因子編碼及水平見表1。

表1 BB實驗因素水平表

1.3.2 山楂果膠固有粘度的測定在室溫條件下，使用奧氏粘度計測定固有粘度（[]）。將果膠溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，配置成濃度為0.1 mg/mL的果膠溶液。取10 mL果膠溶液于粘度計中并記錄溶液流經上下刻度的時間（t）。用0.1mol/L NaCl溶液代替樣品溶液，重復上述操作，記錄時間（0）。固有粘度的計算公式如下[13]：

式中，t和0分別為樣品溶液和0.1 mol/L NaCl溶液流經上下刻度的時間；為樣品溶液的濃度；η和η分別為增比粘度和相對粘度。

1.3.3山楂果膠還原糖含量的測定還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法進行測定[14]。以D-Gal A為標準品，繪制標準曲線，方程為=1.4051-0.1176（2=0.9990）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 H2O2濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響由圖1可知，隨著H2O2濃度的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在60 mmol/L后趨于平穩；還原糖含量隨著H2O2濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在60 mmol/L時還原糖含量最高。高濃度的H2O2反而會抑制果膠的降解，因此，選擇H2O2濃度為60 mmol/L進行響應面實驗。

圖 1 H2O2濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.1 Effect of H2O2concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.2 VC濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響圖2表明隨著VC濃度的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在VC濃度達到10 mmol/L后對固有粘度的影響不顯著（?0.05）；還原糖含量隨著VC濃度的增加而增加（<0.05），在VC濃度為20 mmol/L時達到最大，綜合考慮兩個指標，確定VC濃度為20 mmol/L。

圖2 VC濃度對果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.2 Effect of VC concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.3 超聲次數對果膠固有粘度和還原糖含量的影響通過圖3可知，隨著超聲次數的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在超聲次數達到100次后趨于平穩；還原糖含量隨著超聲次數的增加而增加（<0.05），在超聲次數為200次后變化不顯著（?0.05），分析原因可能是由于加入樣品中的H2O2和VC濃度有限，在達到一定超聲次數后，繼續增加超聲次數并沒有改變產生的自由基數量，所以反應效果也逐漸趨于平穩。綜合考慮固有粘度和還原糖含量，選擇超聲次數為200次進行后續實驗。

圖3 超聲次數對果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.3 Effect of ultrasonic timeson intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.4 超聲振幅對果膠固有粘度和還原糖含量的影響由圖4可以看出，隨著超聲振幅的增加，固有粘度顯著降低（<0.05），在超聲振幅為30%后趨于平穩；還原糖含量在超聲振幅30%時最高，繼續提高超聲振幅，還原糖含量略有降低（?0.05）。可以看出，超聲對反應體系具有催化作用，能夠顯著提高反應速率。考慮能耗等方面，選擇超聲振幅為30%進行響應面實驗。

圖4 超聲振幅對果膠固有粘度和還原糖含量的影響

Fig.4 Effect of ultrasonic amplitude on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.2 響應面優化

根據單因素實驗結果，設計BB實驗，用自變量A、B、C、D表示H2O2濃度（mmol/L）、VC濃度（mmol/L）、超聲次數（次）、超聲振幅（%）四個因素，以還原糖含量為響應值（Y）。利用軟件Design Expert8.0.6對實驗結果進行分析，得到回歸模型參數和方差分析，結果見表2和表3。

表2 BB實驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

Table 3 Variance analysis of regression model

以還原糖含量為響應值，建立二次響應面模型，擬合得方程為：

（還原糖含量）=52.68+0.68+3.72-0.11+0.17+1.34-1.27+1.23-0.012+2.94-0.17-2.172-8.102-3.362-6.522。

根據表2可知，響應面回歸模型極顯著（<0.0001），失擬項不顯著（=0.4753>0.05），相關系數（2）為99.71 %，表明該回歸模型擬合度較高，在各因素的研究范圍內可以較好地預測實際值。此外，較低的變異系數（C.V.=0.93）也說明了回歸模型的可靠性高，誤差較小。根據值和值可知，各因素對還原糖含量的影響大小依次為：VC濃度>H2O2濃度>超聲振幅>超聲次數。其中，VC濃度和H2O2濃度對還原糖含量的影響顯著（<0.001），而超聲振幅和超聲次數對還原糖含量的影響不顯著（>0.05）；二次項、、、、2、2、2和2影響顯著（<0.001）。

將回歸模型中的任意兩個因素固定在零水平，獲得其余兩個因素相互作用對還原糖含量的影響，其響應面圖如圖5所示。

圖5 響應曲面圖

Fig.5 Response surface plots

從圖5a和圖5f中響應面的陡峭程度可以看出，H2O2濃度和VC濃度對還原糖含量的影響顯著，從圖5b和圖5d可以看出，VC濃度對還原糖含量的影響要大于H2O2濃度。同樣的，從圖5c和圖5e可以得到類似的結果。通過比較圖5b和圖5c（或圖5d和圖5e）可知，超聲振幅比超聲次數對還原糖含量的影響大。

2.3 驗證實驗

根據回歸模型得到最佳改性條件為：溫度30 ℃、H2O2濃度65.73 mmol/L、VC濃度21.36 mmol/L、超聲次數206.67次、超聲振幅31.01%，在此條件下，預測還原糖含量為53.29%。根據實驗的可操作性，將實驗條件設定為：溫度30 ℃、H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、超聲次數207次、超聲振幅31%。在此條件下重復三次實驗，還原糖含量為52.22±0.68%，與預測值（53.29%）偏差不大（>0.05）。這表明該模型是可靠的。

3 結 論

本實驗在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken實驗優化了山楂果膠的改性工藝。由響應面分析結果可知各因素對還原糖含量的影響大小依次為：VC濃度>H2O2濃度>超聲振幅>超聲次數，其中VC濃度和H2O2濃度對還原糖含量的影響顯著。綜合回歸模型和驗證實驗，最終確定超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠的最佳條件為：H2O2濃度66 mmol/L、VC濃度21 mmol/L、溫度30 ℃、超聲次數207次、超聲振幅31%，在此條件下進行三次平行驗證實驗，實際測得還原糖含量的平均值為52.22±0.68%，與理論預測值基本一致（>0.05），說明回歸模型的可靠性高。研究表明超聲輔助VC/H2O2改性山楂果膠是一種切實可行的方法，能夠降解果膠，實現果膠高效修飾。

[1] Naqash F, Masoodi FA, Rather SA,. Emerging concepts in the nutraceutical and functional properties of pectin-A Review[J]. Carbohydrate Polymers, 2017,168:227-239

[2] 張麗芬.果膠多糖超聲波定向降解途徑及機理研究[D].江蘇:江南大學,2013

[3] 吳瞻邑,劉素穩,崔麗賢,等.酸提山楂果膠理化特性及抗氧化性[J].食品工業科技,2018,39(18):1-5,11

[4] 劉素穩,吳瞻邑,由璐,等.山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對中波紫外線輻射HaCaT細胞氧化損傷和光老化的保護作用[J].食品科學,2018,39(21):210-218

[5] 董銀萍,李拖平.山楂果膠的抗氧化活性[J].食品科學,2014,35(3):29-32

[6] 王巍.山楂果膠寡糖制備及抑菌性能研究[D].河北:河北科技大學,2018

[7] Zhang ZS, Wang XM, Zhao MX,. Free-radical degradation by Fe2+/Vc/H2O2and antioxidant activity of polysaccharide from Tremella fuciformis[J]. Carbohydrate Polymers, 2014,112:578-582

[8] Zhou CS, Yu XJ, Zhang YZ,. Ultrasonic degradation, purification and analysis of structure and antioxidant activity of polysaccharide fromUdea[J]. Carbohydrate Polymers, 2012,87:2046-2051

[9] Ma XB, Wang DL, Chen WJ,. Effects of ultrasound pretreatment on the enzymolysis of pectin: Kinetic study, structural characteristics and anti-cancer activity of the Hydrolysates[J]. Food Hydrocolloids, 2018,79:90-99

[10] 張文博,劉振華,袁雪艷,等.改性果膠抗腫瘤機制研究進展[J].食品科學,2015,36(15):293-298

[11] 劉閃閃.柑橘囊衣低聚果膠及其磺化衍生物的制備及活性研究[D].浙江:浙江大學,2018

[12] 邱軍強,張華,劉迪迪,等.超聲波處理對多糖理化性質和生物活性的影響[J].食品研究與開發,2017,38(16):189-193

[13] Wu JW, Li P, Zhao HT,Effect of solution plasma process with hydrogen peroxide on the degradation and antioxidant activity of polysaccharide from[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018,117:1299-1304

[14] 梁瑞紅,王玲華,帥希祥,等.動態高壓微射流處理對低酯果膠物化性質及其結構的影響[J].現代食品科技,2015,31(1):

115-119,114

Study on the Hawthorn Pectin Modified by which Response Surface Optimized Ultrasonic with VC/H2O2

ZHU Yi-wei1, CHEN Xiao-wen1, ZHAO Li-wei2, ZHU Chuan-he1*

1.271018,2.221000,

Pectin is an acidic polysaccharide, which is widely used in food industry and other industrial fields. The biological activity of pectin is closely related to its molecular weight and structure. Using the hawthorn pectin in the laboratory as raw material, we adopted ultrasound-assisted VC/H2O2to modify hawthorn pectin, and optimized the modification process by single factor experiment and response surface experiment with the inherent viscosity and reducing sugar content as indicators. The results show that the best process parameters were: H2O2concentration 66 mmol/L, VC concentration 21 mmol/L, temperature 30 °C, pulse number 207 and ultrasonic amplitude 31%. Under these conditions, the reducing sugar content of pectin was 52.22±0.68%, which was basically consistent with the predicted value. It shows that the model has reliability.

Hawthorn pectin; modification; ultrasonic with VC/H2O2

TS201.7

A

1000-2324(2019)04-0686-06

2019-04-04

2019-04-21

山東省2017年度農業重大應用技術創新項目;山東省重點研發計劃(GG201703080015);山東省“雙一流”獎補資金資助(SYT2017XTTD04);泰安市大學生科技創新行動計劃

朱毅偉(1998-),女,在校本科生,專業方向:食品質量與安全(中英). E-mail:1260193690@qq.com

Author for correspondence. E-mail:chhzhu@sdau.edu.cn