知柏地黃湯對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制

伍啟華

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院，廣東佛山 528000）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起，以持續(xù)血糖升高，伴血脂異常為特征的慢性代謝性疾病[1]。T2DM可以引起冠心病、慢性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜損害、糖尿病足等嚴(yán)重并發(fā)癥，致死率和致殘率高，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量，已經(jīng)成為影響人類健康的非傳染性疾病[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球T2DM患者約3.8億，而我國T2DM患者高達(dá)1.1億，隨著生活、飲食和運(yùn)動(dòng)方式的改變，T2DM的發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢(shì)[3，4]。中醫(yī)藥防治糖尿病歷史悠久。T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，其病因病機(jī)總屬陰虛燥熱。知柏地黃湯出自《醫(yī)宗金鑒》，具有益氣養(yǎng)陰清熱等功效，吾導(dǎo)師課題組及團(tuán)隊(duì)將知柏地黃湯臨床上用于治療T2DM，具有一定的療效，但關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。炎癥學(xué)說和氧化應(yīng)激損傷學(xué)說備受關(guān)注，兩者在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[5]。因此，本研究以T2DM大鼠模型為研究對(duì)象，給予知柏地黃湯進(jìn)行干預(yù)，初步觀察其對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用和對(duì)炎癥因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以期為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料健康SD雄性大鼠60只，無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級(jí)，6周齡，體質(zhì)量140～160 g。高脂高糖飼料按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比：15%蔗糖、15%豬油、4.5%膽固醇、66.5%基礎(chǔ)飼料。大鼠及飼料均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于佛山市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～28℃、相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。

1.2藥物與制備知柏地黃湯組成：知母6 g、黃柏6 g、熟地黃24 g、山萸肉12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g。上述中藥材由佛山市中醫(yī)院藥劑科提供。將上述藥材加10倍量的水煎煮2次，將2次藥液混合后，100℃濃縮至2 g/mL。

1.3試劑和儀器鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（上海寶曼生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），單細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemotactic factor-1，MCP-1），白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6），高敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reaction protein，hs-CRP），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（蘇州瑞諾德生物科技有限公司）；空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS），C肽（C-peptide，C-P）放射免疫法試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。血糖分析儀（美國強(qiáng)生公司）；自動(dòng)生化分析儀（博科控股集團(tuán)有限公司）。

1.4動(dòng)物分組和模型構(gòu)建60只大鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和蒸餾水1周后，隨機(jī)分為空白組（N=15）和造模組（N=45）。造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周，禁食不禁飲16 h后，給予鏈脲佐菌素——檸檬酸緩沖溶液50 mg/kg經(jīng)腹腔注射[6]。空白組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周，禁食不禁飲16 h后，給予等劑量的檸檬酸緩沖溶液腹腔注射。72 h后，檢測大鼠尾靜脈空腹血糖（FBG），若FBG≥16.7 mmol/L且持續(xù)1周不變者則判斷T2DM大鼠模型復(fù)制成功[7]。結(jié)果顯示造模組有36只大鼠符合T2DM大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)。將該36只大鼠隨機(jī)分為模型組（N=12）、中藥組（N=12）和羅格列酮組（N=12）。

1.5給藥方法大鼠給藥劑量按人與大鼠之間體表面積折算公式[8]，計(jì)算后知柏地黃湯等效劑量為3.8 g·kg-1·d-1，羅格列酮等效劑量為4.0 mg·kg-1·d-1。中藥組大鼠組給予知柏地黃湯（劑量為3.8 g·kg-1·d-1）灌胃，羅格列酮組大鼠給予羅格列酮（加生理鹽水配制成2.0 mg/mL，劑量為 4.0 mg·kg-1·d-1）灌胃，空白組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃8周。給藥期間，空白組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.6實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)各組大鼠灌胃8周后，禁食不禁飲16 h后，尾靜脈采血后使用血糖監(jiān)測儀檢測FBG。造模成功的大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，從腹主動(dòng)脈采血30 mL，3 000 r/min離心15 min，取血清，-80℃保存待測。全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；ELISA法檢測血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP、SOD、MDA、GSH-PX的水平；放射免疫法測定血清FINS、C-P水平；采用糖化血紅蛋白分析儀檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。

1.7統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血清FBG、FINS、C-P、HbA1c水平的比較表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清FBG、HbA1c水平明顯升高，F(xiàn)INS、C-P水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、羅格列酮組大鼠血清FBG、HbA1c水平明顯降低，F(xiàn)INS、C-P水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示知柏地黃湯可調(diào)節(jié)T2DM大鼠糖代謝。

表1 各組大鼠血清FBG、FINS、C-P、HbA1c水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of FBG，F(xiàn)INS，C-P，and HbA1c in various groups (-x±s)

2.2各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的比較表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、羅格列酮組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示知柏地黃湯可調(diào)節(jié)T2DM大鼠脂代謝。

2.3各組大鼠血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP水平的比較表3結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、羅格列酮組大鼠血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示知柏地黃湯可抑制T2DM大鼠的炎癥反應(yīng)。

表2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的比較Table 2Comparison of the serum levels of TC，TG，LDL-C，and HDL-C in various groups[-x±s，c/（mmol·L-1）]

表3 各組大鼠血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP水平的比較Table 3 Comparison of the serum levels of TNF-α，MCP-1，IL-6，and hs-CRP in various groups (-x±s)

2.4各組大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX活性的比較表4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清MDA水平明顯升高，SOD、GSH-PX水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠血清MDA水平明顯降低，SOD、GSH-PX水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示知柏地黃湯可以改善T2DM大鼠氧化應(yīng)激損傷。

表4 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX活性的比較Table 4 Comparison of the serum activities of SOD，MDA，and GSH-PX in various groups (-x±s)

3 討論

糖尿病是最常見的慢性代謝性疾病，常伴有血脂異常，T2DM是糖尿病的主要類型，占90%以上。T2DM是動(dòng)脈粥樣硬化最重要的危險(xiǎn)因素，可以引起心、腦、腎、眼等重要靶器官的損傷，已經(jīng)成為影響人類健康的第三大疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和健康。因此，積極干預(yù)T2DM對(duì)改善患者的健康、生活質(zhì)量和預(yù)后，減少致殘具有重要的意義。T2DM的主要環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能損傷引起不同程度的胰島素分泌障礙。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療T2DM主要以改善飲食方式、運(yùn)動(dòng)、服用降糖藥和皮下注射胰島素等控制血糖為主，但未能從根本上解決糖代謝紊亂，因此如何恢復(fù)胰島細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)糖代謝是治療T2DM的主要研究方向。

關(guān)于T2DM的具體機(jī)制尚不完全明確。有學(xué)者提出T2DM是一種慢性炎癥性疾病，長期處于低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)[9]。炎癥因子可以引起胰島β細(xì)胞損傷甚至死亡，導(dǎo)致其分泌胰島素合成減少或分泌障礙。TNF-α可以通過影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制葡萄糖攝取、促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂肪酸的分解、促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡等途徑介導(dǎo)糖尿病的發(fā)生發(fā)展[10]。IL-6可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解為脂肪酸、促進(jìn)脂質(zhì)過氧化、激活絲氨酸激酶促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡等引起胰島素分泌障礙，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[11]。MCP-1可以作用于單核巨噬細(xì)胞，促進(jìn)單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)壁，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，最終引起β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌障礙，而且可以介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化[12]。hs-CRP是急性期反應(yīng)蛋白，與機(jī)體炎癥損傷程度呈正相關(guān)性。有研究顯示，T2DM患者血清TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP等炎癥因子水平明顯高于健康人群，而抑制炎癥因子表達(dá)可以改善糖脂代謝[13]。氧化應(yīng)激損傷在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中同樣起到重要的作用，體內(nèi)持續(xù)的高血糖可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)氧自由基含量升高，造成胰島β細(xì)胞功能障礙或死亡，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，促進(jìn)T2DM的進(jìn)展[14]。氧化應(yīng)激還可以抑制胰島素受體和胰島素結(jié)合，引起葡萄糖攝取障礙，還可以引起組織器官發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生[15]。MDA是機(jī)體內(nèi)最重要的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，可以損傷胰島β細(xì)胞膜，代表機(jī)體氧化損傷的程度。SOD是MDA最主要的清除酶，代表機(jī)體抗氧化損傷能力。GSH-PX可以清除活性代謝產(chǎn)物和氧自由基，保護(hù)胰島β細(xì)胞免受氧化攻擊。當(dāng)MDA分泌過多或清除不足或SOD、GSH-PX生成減少時(shí)，可以導(dǎo)致β細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，飲食不節(jié)、勞倦等損傷脾、肺、腎三臟，耗氣傷陰，氣陰不足，氣虛無以化生水谷津液，陰虛生內(nèi)熱，發(fā)為消渴病[16，17]。因此，T2DM的病機(jī)主要為陰津虧損，燥熱偏盛。知柏地黃丸方中知母、黃柏清熱生津，熟地黃補(bǔ)血生津、填精益髓，山萸肉補(bǔ)益肝腎、生津止渴，山藥健脾、補(bǔ)肺、固腎、益氣生津，茯苓健脾利濕，牡丹皮清熱涼血，澤瀉利濕清熱。諸藥合而成方，共奏益氣、生津、清熱之功。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制T2DM大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥組和羅格列酮組，分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠血清 FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP、MDA水平明顯升高，F(xiàn)INS、C-P、HDL-C、SOD、GSH-PX水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射可成功建立T2DM大鼠模型，而且炎癥因子和氧化應(yīng)激損傷在T2DM的發(fā)展中具有一定的作用。與模型組比較，中藥組大鼠血清FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、TNF-α、MCP-1、IL-6、hs-CRP、MDA水平明顯降低，F(xiàn)INS、C-P、HDL-C、SOD、GSH-PX水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示知柏地黃湯可以降低T2DM大鼠血糖和血脂，改善胰島素抵抗、抑制炎癥因子的表達(dá)、減少氧化應(yīng)激損傷、恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能。

綜上所述，知柏地黃湯可調(diào)節(jié)T2DM大鼠的糖脂代謝紊亂，可能與抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。