心脈通軟膠囊的質(zhì)量控制及穩(wěn)定性考察

鄭 林，劉麗娜，李月婷，李勇軍，黃 勇，王永林，蘭燕宇

（貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

心脈通軟膠囊具有活血化瘀、通脈止痛的功效，臨 床用于冠心病心絞痛心血瘀阻所致胸痹心痛證，癥見胸悶、胸部刺痛，固定不移，心悸不寧，現(xiàn)已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。其由葒草、山楂葉、三七等多味中藥組方，主藥為葒草，有效成分異葒草素、葒草素具有抗氧化、抗凝血、抗菌等作用[1-3]，為葒草中主要活性成分。為有效控制該制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)中建立了方中葒草、山楂葉和三七鑒別的薄層色譜法和異葒草素、葒草素含量測(cè)定的高效液相色譜法，并考察了心脈通軟膠囊的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

儀器：LC-10Avp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；WD-A型藥物穩(wěn)定性檢查儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；AE2401型電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；WP-UP-Ⅱ-20型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；CX-250型超聲波清洗器（功率為250 W，頻率為27～34 kHz，北京醫(yī)療設(shè)備二廠）。

試藥：葒草對(duì)照藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為正品，山楂葉對(duì)照藥材（批號(hào)為121340-200601）、三七對(duì)照藥材（批號(hào)為120941-200807）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異葒草素對(duì)照品、葒草素對(duì)照品（貴州醫(yī)科大學(xué)藥物研究開發(fā)中心用葒草藥材制備，純度大于98%）；心脈通軟膠囊(貴州醫(yī)科大學(xué)藥物研究開發(fā)中心提供，批號(hào)為 20120706，20120715，20120724）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；硅膠G預(yù)制板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[4-7]

葒草：取本品內(nèi)容物 0.3 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為50 kHz）處理5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，加水15 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液；另取葒草對(duì)照藥材1 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，揮干，殘?jiān)铀?5 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含葒草的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0502]試驗(yàn)，吸取上述 3種溶液各 2 μL，分別條帶狀點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10 ∶0.25 ∶0.25，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1 A。

山楂葉：取本品內(nèi)容物 0.2 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為 50 kHz）處理 5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，沉淀加甲醇10 mL，漩渦混勻，濾過，濾液作為供試品溶液；取山楂葉對(duì)照藥材0.2 g，加乙醇30 mL，加熱回流 1.5 h，濾過，揮干，殘?jiān)铀?15 mL，用石油醚（60～90℃）20 mL萃取，下層液用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并上層液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含山楂葉的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別條帶狀點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇 -水（2∶1，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1 B。

三七：取本品內(nèi)容物 0.25 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為 50 kHz）處理 5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，加氨試液5 mL溶解，用正丁醇萃取2次，每次5 mL，合并上層溶液，加水5 mL，振搖提取，取上層液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取三七對(duì)照藥材 0.5 g，加水 5 mL，加正丁醇 5 mL，振搖提取，取上層液，加水15 mL，振搖提取，取上層液揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含三七的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別條帶狀點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇 -水（65∶30∶10，V／V／V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于115℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

2.2 異葒草素和葒草素含量測(cè)定[8-9]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsiL C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（15 ∶85，V／V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL ／min。

2.2.2 溶液制備

稱取異葒草素、葒草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為 221.0，216.5 μg ／mL的混合對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物3 g，精密稱定，加乙醚10 mL，超聲（功率為220 W，頻率為50 kHz）處理5 min，棄乙醚液，沉淀加50%乙醇適量溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例制成缺葒草的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，異葒草素、葒草素分別有相同保留時(shí)間的色譜峰，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣測(cè)定，繪制工作曲線，計(jì)算得異葒草素、葒草素的線性回歸方程分別為 Y異＝23 472 860 X異-5 714（r＝0.999 9，n＝5），Y葒＝21 909 536 X葒＋2 195（r＝0.999 7，n＝5）。結(jié)果表明，異葒草素和葒草素的質(zhì)量濃度分別在 11.05 ～88.40 μg／mL 和 10.83 ～86.60 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一供試品，依法制得供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果異葒草素和葒草素峰面積的 RSD分別為 1.52%和 0.63%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果異葒草素和葒草素峰面積的 RSD分別為 1.69%和 1.23%(n＝5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品，依法制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果異葒草素平均含量分別為 0.287 2% 和 0.178 8% ，RSD 分別為 1.53% 和1.83%(n＝5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的供試品（異葒草素和葒草素含量分別為0.287 2%和0.178 8%），分別精密加入異葒草素和葒草素對(duì)照品適量，依法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.3 穩(wěn)定性考察[10-11]

各項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：見表2。

加速試驗(yàn)：取模擬上市包裝樣品，置溫度（40±2）℃、相對(duì)濕度（75 ± 5）% 條件下貯藏，分別于 0，1，2，3，6 個(gè)月取樣，照心脈通軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。結(jié)果3批樣品經(jīng)加速試驗(yàn)6個(gè)月考察，外觀性狀、裝量差異、崩解時(shí)限、微生物限度等各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均符合規(guī)定；3批樣品中異葒草素和葒草素含量之和分別為 4.25，4.33，4.14， 4.15， 4.10 mg／粒 （ 批 號(hào) 為 20120706）； 3.56，3.71，3.65，3.56，3.51 mg／粒（批號(hào)為 20120715）；3.78，3.69，3.89，3.68，3.63 mg ／粒（批號(hào)為 20120724）。制劑中異葒草素和葒草素含量無明顯變化，且均能檢出葒草、山楂葉和三七，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

長(zhǎng)期試驗(yàn)：取模擬上市包裝樣品，置室溫條件下貯藏，在 0，3，6，12，18，24 個(gè)月取樣，照心脈通軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)24個(gè)月長(zhǎng)期試驗(yàn)考察，樣品外觀性狀、裝量差異、崩解時(shí)限、微生物限度等各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均符合規(guī)定；3批樣品中異葒草素和葒草素含量之和分別為 4.25，4.10，4.19，4.31，4.14，4.13 mg／粒（批號(hào)為20120706），3.56，3.48，3.71，3.60，3.47，3.48 mg ／粒（批 號(hào) 為 20120715），3.78，3.91，3.95，3.82，3.72，3.77 mg ／粒（批號(hào)為 20120724）。制劑中異葒草素和葒草素含量無明顯變化，且均能檢出葒草、山楂葉和三七，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 各項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

采用薄層色譜法對(duì)心脈通軟膠囊中的葒草、山楂葉和三七藥材進(jìn)行定性鑒別，在薄層色譜中分別檢出葒草、山楂葉和三七的特征斑點(diǎn)，斑點(diǎn)分離清晰，陰性對(duì)照無干擾，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為心脈通軟膠囊有效的定性鑒別方法。

采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中異葒草素和葒草素時(shí)，由于本品為軟膠囊，含有大豆油，為避免污染色譜柱，樣品不能直接溶解進(jìn)樣。異葒草素、葒草素為黃酮類化合物，能溶于乙醇等極性溶劑，而不溶于非極性有機(jī)溶劑，在供試品溶液制備方法研究過程中，分別采用了石油醚、乙醚、氯仿等溶劑去除樣品中油脂類物質(zhì)，結(jié)果表明采用乙醚去除油脂操作簡(jiǎn)便，效果較好。

在樣品穩(wěn)定性考察試驗(yàn)中，根據(jù)《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[2015年版《中國(guó)藥典（四部）》指導(dǎo)原則9001]，取3批市售制劑，進(jìn)行加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)考察，除葒草、山楂葉和三七藥材的薄層鑒別，以及異葒草素和葒草素的含量測(cè)定外，還分別考察了外觀性狀、崩解時(shí)限、微生物限度，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。說明本品在24個(gè)月內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定，直接接觸藥品的容器對(duì)藥品質(zhì)量無影響，故心脈通軟膠囊的有效期暫定為24個(gè)月，為控制藥品質(zhì)量及確定藥品貯存條件提供了科學(xué)依據(jù)。