川芎嗪防護嚴重燒傷大鼠急性肺損傷及對NF- B／NLRP3信號通路的影響

劉馳星，何樹清 ，詹劍華

（1.中國人民解放軍聯勤保障部隊908醫院，江西 南昌 330002； 2.南昌大學醫學院第一附屬醫院，江西 南昌 330002）

急性肺損傷（ALI）及其所引發急性呼吸窘迫綜合征是廣泛性皮膚燒傷患者高發病率和高死亡率的主要原因，臨床表現為低氧血癥、非心源性肺水腫和急性呼吸衰竭。嚴重燒傷所致的ALI延遲復蘇被認為是對肺的間接（繼發）損傷且與急性全身炎性反應綜合征相關[1-3]。嚴重的燒傷和復蘇延遲可引發過度的炎性反應，表現為局部和全身炎性介質過表達。核因子κB（NF-κB）的激活可調節一系列基因表達，以及腫瘤壞死因子-α（TNF- α）、白細胞介素 2（IL-2）、白細胞介素 6（IL-6），均可導致肺組織損傷[4-5]。NLRP3是一種由Nod樣受體（NLR）家族組成的多蛋白復合物，在ALI中起重要作用。NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1組成，其激活可誘導IL-1β的成熟和分泌。因此，抑制NF-κB和NLRP3炎性體的活性可抑制由嚴重燒傷誘導的肺組織的炎性反應[6-7]。川芎嗪來源于草藥川芎，具有抗炎、抗癌作用，可改善肺癌患者胸腔積液[8-9]，抑制人表皮角質形成細胞的炎性反應。本研究中擬探討川芎嗪對嚴重燒傷大鼠ALI防護作用及NF-κB／NLRP3信號通路的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

Sprague-Dawley大鼠 60只，6～8周齡，體質量250～300 g，由山東大學醫學院動物實驗中心提供（許可證號為SCXK＜魯＞20001003）；本研究方案經醫院動物研究委員會批準，符合美國國立衛生研究院動物使用和護理指南。動物隨意獲取食物和水，自動控制晝夜循環（12 h ／12 h），室溫（22 ± 1）℃ 。將大鼠隨機分為對照組、模型組、川芎嗪組，每組20只，雌雄各半。

1.2 方法

使用具有圓形開口的木板暴露大鼠30%的總體表面積。通過腹膜內注射戊巴比妥鈉（劑量為30 mg／kg）麻醉后，夾住模型組、川芎嗪組大鼠的背毛，使其仰臥在裝置上。將具有木制裝置的大鼠背部區域浸入熱水（100℃）中15 s，產生全層皮膚燒傷；通過組織學驗證燒傷創面深度；燒傷后4 h通過腹膜內注射每1 kg體質量4 mL體內表面積的乳酸林格溶液復蘇。大鼠皮下注射丁丙諾啡0.25 mg／kg，并單獨用籠子飼養。川芎嗪組在燒傷后立即予大鼠腹膜內注射50000U／kg注射用鹽酸川芎嗪（哈爾濱三聯藥業股份有限公司，國藥準字H20041171，規格為每支40 mg）。模型組大鼠僅接受較少量的載體（0.9%氯化鈉注射液，USP標準品，上海現代哈森＜商丘＞藥業有限公司）。對照組采用37℃溫水予相同程序和復蘇。

1.3 指標測定

濕肺／體質量及肺損傷評分：試驗結束后（6 h后），頸椎脫臼處死大鼠，取右肺組織，測定濕肺／體質量。隨后取右側部分肺組織，行常規染色切片，鏡下閱片，對肺泡內充血、肺間質水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡水腫進行評分。極重度改變為4分、重度改變為3分、中度改變為2分、輕度改變為1分、無改變或非常輕微為0分，上述4項總分即為肺損傷評分。燒傷后6 h，收集3組大鼠外周動脈血樣品，使用GEM Premier 3000型血氣分析儀（Instrumentation Laboratory，Breda，The Netherlands）分析動脈氧分壓（PaO2）。

大鼠肺組織NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA表達水平：使用 RNeasy 試劑盒（Qiagen，Valencia，CA）從肺組織中分離總 RNA，測定其濃度和純度，使用 Access RT-PCR 系統（Bio-Rad，Hercules，CA）進行逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。參照 GenBank數據獲取 2個基因位點的序列，設計待測基因位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，使用One Step Prime Script miRNA cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將RNA逆轉錄為cDNA，并使用 SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）進行定量實時PCR 使 用 引 物 。 NF-κB， 正 向 5′-CCGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCA-3，反向 5′-TCCTTAGGGCA AGGGCTCTTGATGG-3′；NLRP3，正向 5′-GAATGACCTGTTCTTTGA GGCTGAC-3；GAPDH用作管家基因：正向 5′-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3，反向5′-GATACATTGGGGGTAGGAACACGGA-3。反應體系為，正向引物 10 μL，反向引物 10 μL，RNA 模版 0.6 μL，超級酶混合物 0.2 μL，2×μByr一步法 RT-qPCR 緩沖液 5 μL，去 RNA 水 3.4 μL；PCR 程序，95 ℃ 下，初始變性 5 min；95 ℃ 下，熔化 30 s；60 ℃ 下，退火 40 s；在72℃下，伸長 1 min；在 10℃下，最終伸長10個循環；72 ℃ 下 2 min，保持在 4 ℃ 。通過 2-ΔΔCT方法計算NF-κB和NLRP3相對表達水平。

大鼠肺部組織NF-κB和NLRP3蛋白表達水平：免疫組化法測定NF-κB和NLRP3蛋白在大鼠肺部組織的表達，石蠟包埋的肺組織切片用1%H2O2處理，以抑制內部過氧化物酶，并與牛血清預孵育以阻斷非特異性結合。切片與 NF-κB和 NLRP3一抗（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz）孵育，4 ℃過夜。將生物素化的二抗（ProSci，Poway，CA）應用于樣品 1 h。ABC 試劑盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）和 3，3′- 二氨基聯苯胺用于顯色。隨機選擇圖像并使用TE300型顯微鏡（日本尼康公司）捕獲。隨機選取5個高倍視野（×400）計數，設立陰性對照（用PBS來替代一抗體，染色結果作為陰性，排除染色過程中非特異染色和交叉反應所造成的假陽性結果）和陽性對照（用Dako公司生產的一抗作為陽性對照，染色結果作為標準結果）。采用雙盲法統計結果，評分標準，0 分（0），1 分（0～10% ），2 分（10～50%）和 3分（＞50%）。強度評分，0分（陰性染色），1分（弱染色），2分（中度染色）和 3分（強烈染色）。通過將陽性比例得分乘以染色強度得分來計算NF-κB和NLRP3表達的最終得分，范圍為0～9分。

大鼠肺組織中 IL-2，IL-6，TNF-α蛋白表達水平：按照無菌條件操作，稱取0.1 g肺組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將肺組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入 2 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH ＝7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細收集上清液，獲取肺組織勻漿后，采用ELISA法檢測肺組織中IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平。

表1 各組大鼠觀察指標比較（X±s，n＝20）

圖1 各組大鼠右側肺組織HE、NF- B表達、NLRP3表達染色圖（×400）

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件分析。計量資料以 X±s表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α＝0.05，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見表1和圖1。由圖1 A可見，對照組大鼠肺泡組織結構正常，無炎性細胞浸潤、無膠原蛋白沉淀；模型組大鼠肺泡壁明顯增厚、破裂，可見中性粒細胞及少量嗜酸性粒細胞浸潤，肺間質可見較多膠原蛋白沉淀；川芎嗪組大鼠肺泡結構基本正常，有少量中性粒細胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。采用免疫組化法，NF-κB和NLRP3主要定位于胞質，其陽性表達為棕褐色。

3 討論

肺部通常是燒傷后損傷的第1個器官，即使沒有吸入性損傷和感染，也會繼發ALI。此外，肺功能的損害如炎性反應和嚴重的低氧血癥，會損害其他器官和組織，從而導致多器官功能障礙綜合征的進展。因此，鑒定燒傷誘導ALI的早期介質及其潛在的分子機制至關重要。本研究結果顯示，與模型組比較，川芎嗪組濕肺／體質量比值、肺損傷評分明顯降低，PaO2水平明顯升高；對照組肺泡組織結構正常，無炎性細胞浸潤、無膠原蛋白沉淀；川芎嗪組肺泡結構基本正常，有少量中性粒細胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。這表明川芎嗪對嚴重燒傷誘導大鼠ALI具有保護作用，濕肺／體質量比值、肺損傷評分均明顯降低，PaO2水平明顯升高，炎性細胞因子減少，纖維蛋白原和炎性細胞浸潤減輕。

NF-κB是參與炎性反應的重要轉錄因子，可誘導大量炎性細胞的表達，在損傷后作為炎癥的早期內源性警報細胞外釋放，較其他促炎細胞因子早釋放，并作為膿毒癥的“早期介質”[10]。阻斷NF-κB活性，可降低動物內毒素血癥模型的死亡率。未活化的NF-κB以具有IκB的聚合物形式或以與前體蛋白的2種聚合物形式存在。在炎癥誘導因子的刺激中，NF-κBp65從細胞質轉移到細胞核中以調節炎性細胞因子的表達[11]。NRPRP炎癥小體激活和IL-1β分泌最近成為肺損傷等疾病發病的重要機制。與銜接蛋白ASC復合的NLRP3誘導Caspase-1的激活，以響應各種刺激[12]。活化的 Caspase-1切割pro-IL-1β 并促進 IL-1β 的分泌。NLRP3／ASC／Caspase-1軸在LPS誘導的肺損傷中起重要作用，抑制NLRP3炎性體激活具有抵抗脂多糖誘導急性肺損傷的能力[13]。本研究中，為了闡明川芎嗪的保護機制，檢測了川芎嗪對NF-κB和NLRP3炎癥小體的影響。結果顯示，與模型組比較，川芎嗪組大鼠肺NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平均明顯降低，表明川芎嗪通過抑制NF-κB和NLRP3炎性表達的活化來抑制炎性反應。模型組、川芎嗪組大鼠肺IL-2，IL-6，TNF-α表達水平均明顯升高；與模型組大鼠比較，川芎嗪組大鼠IL-2，IL-6，TNF-α表達水平均明顯降低。說明川芎嗪能抑制炎癥信號通路NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平，從而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達。

綜上所述，川芎嗪對嚴重燒傷大鼠ALI有防護作用，其機制與川芎嗪能抑制炎癥信號通路NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平，從而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α 的表達有關。