高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方水楊酸硫乳膏中水楊酸和醋酸氯己定含量

彭賢東，王婭俐，王 丹，潘良平，唐志立

（四川省南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，四川 南充 637000）

復(fù)方水楊酸硫乳膏是自制醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑（川藥制字H20080472），主要成分為水楊酸、升華硫和醋酸氯己定，用于體癬、頭癬、脂溢性皮炎及疥瘡療效顯著。水楊酸具有促進(jìn)表皮角質(zhì)層正常化、改善表皮通透屏障功能[1]和抗真菌、止癢、溶解角質(zhì)的作用；醋酸氯己定是常用皮膚黏膜消毒劑，在有效濃度下部分葡萄球菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、大腸埃希菌、丙酸桿菌等對(duì)其敏感[2]，具有強(qiáng)抗菌作用；升華硫具有殺疥蟲、殺真菌作用，能去除油脂，并可促進(jìn)角質(zhì)溶解。原四川省食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用了酸堿中和滴定法測(cè)定水楊酸的含量，并未對(duì)醋酸氯己定進(jìn)行含量控制。水楊酸的含量測(cè)定方法有酸堿中和滴定法、紫外分光光度法[3]、高效液相色譜（HPLC）法[4]等。由于乳膏基質(zhì)為酸性，因此酸堿中和滴定法測(cè)定乳膏中水楊酸的含量偏高；其基質(zhì)又有紫外吸收，因此用紫外分光光度法直接測(cè)定水楊酸的含量會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。醋酸氯己定的含量測(cè)定方法有滴定分析法、紫外分光光度法[5-6]、HPLC法[7-9]等。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，本研究中采用HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方水楊酸硫乳膏中水楊酸和醋酸氯己定的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，UV-1800型紫外-可見分光光度儀（日本島津公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）；pHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

復(fù)方水楊酸硫乳膏（南充市中心醫(yī)院，批號(hào)為180122，180123，180124，規(guī)格為每 1 g 含水楊酸 10 mg、升華硫100 mg、醋酸氯己定0.5 mg）；水楊酸對(duì)照品（批號(hào)為 100106-201605，含量 99.7%），醋酸氯己定對(duì)照品（批號(hào)為 100183-201604，含量 96.9%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Atlantis C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水（乙酸銨 26 g和三乙胺 37 mL，加水至1 000 mL，并用冰醋酸調(diào) pH 至 4.0）-甲醇（50∶50，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按水楊酸峰、醋酸氯己定峰計(jì)算均應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液制備

取水楊酸對(duì)照品 200.46 mg、醋酸氯己定對(duì)照品10.32 mg，精密稱定，置同一 100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得含水楊酸、醋酸氯己定成分的對(duì)照品貯備液；精密量取上述貯備液7.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.299 8 g／L的水楊酸和0.015 0 g／L 的醋酸氯己定）。取本品 3 g（約含水楊酸30 mg，醋酸氯己定 1.5 mg），精密稱定，置 100 mL 容量瓶中，加甲醇適量，于50℃水浴中加熱并時(shí)時(shí)振搖，使乳膏充分分散，水楊酸和醋酸氯己定溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例制備不水楊酸和醋酸氯己定的陰性對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，分別按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果水楊酸、醋酸氯己定的保留時(shí)間分別約為4.4 min和14.7 min，理論板數(shù)按醋酸氯己定峰計(jì)算為3 479，樣品中水楊酸與醋酸氯己定分離完全，與其他組分分離良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液，加甲醇分別稀釋成含水楊酸、醋酸氯己定質(zhì)量濃度分別為0.099 9，0.1999，0.2998，0.3997，0.4996，0.5996g／L 和 0.005 0，0.010 0，0.015 0，0.020 0，0.025 0，0.030 0 g ／L 的溶液，進(jìn)樣 10 μL，依法測(cè)定。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得水楊酸、醋酸氯己定回歸方程分別為 A水＝1.92×106C水＋3333.1(r＝0.999 9，n＝6）和 A醋＝2.43×107C醋＋2 866.7(r＝0.999 9，n ＝6）。結(jié)果表明，水楊酸、醋酸氯己定檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為 0.099 9～0.599 6 g／L 和0.0050 ～0.0300 g ／L。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果水楊酸、醋酸氯己定峰面積的 RSD 分別為 0.55% 和 0.82% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180122）6份各3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣 10 μL，記錄峰面積。結(jié)果水楊酸、醋酸氯己定含量的 RSD分別為0.67% 和 0.70%（n ＝6），表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為180122），分別于 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣 10 μL，記錄峰面積。結(jié)果水楊酸、醋酸氯己定峰面積 RSD分別為0.84%和1.00%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收試驗(yàn)：根據(jù)處方工藝，稱取陰性對(duì)照品適量，分別加入水楊酸和醋酸氯己定對(duì)照品，制成相當(dāng)于標(biāo)示量80%，100%，120%的模擬樣品，依法制備供試品溶液，每種質(zhì)量濃度制備3份，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

曾考察甲醇 -水 -冰醋酸（50∶50∶1，V／V／V）、磷酸二氫鉀 -甲醇（70∶30，V／V）、磷酸二氫鉀 -乙腈（65 ∶35，V／V），發(fā)現(xiàn)醋酸氯己定均不能很好地出峰，最終選擇本流動(dòng)相。考察了甲醇 -水（55∶45，V／V），發(fā)現(xiàn)溶劑峰與水楊酸峰分離度小，因此調(diào)高水相比例[甲醇-水（50∶50，V／V）]使水楊酸保留時(shí)間延長(zhǎng)，基質(zhì)峰與水楊酸和醋酸氯己定峰分離較好，保留時(shí)間恰當(dāng)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別配制10 μg／mL的水楊酸和醋酸氯己定甲醇溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外掃描，結(jié)果水楊酸在234.1 nm和303.9 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，醋酸氯己定在257.8 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。因復(fù)方水楊酸硫乳膏中醋酸氯己定的含量只有水楊酸含量的1／20，水楊酸在257 nm波長(zhǎng)處也有一定的吸收，且2種成分峰面積均較適宜，峰形好，故選擇257 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 pH 選擇

水楊酸酸性較弱，因?yàn)槠溧徫涣u基對(duì)羧基的影響，互相容易形成分子內(nèi)氫鍵，使得氫原子解離成質(zhì)子[10]，因而其在水中會(huì)發(fā)生電離，從而會(huì)產(chǎn)生拖尾。為了使水楊酸盡可能以分子形式存在，擬采用冰醋酸來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制水楊酸的解離。當(dāng)pH調(diào)節(jié)為4時(shí)，可很好地抑制水楊酸的解離，減少拖尾現(xiàn)象，得到了滿意的峰形。