高效液相色譜法測(cè)定雙醋瑞因膠囊的有關(guān)物質(zhì)

楊文鳳，石 穎，張慧文

（廣東省廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510160）

雙醋瑞因（C19H12O8）屬蒽醌類(lèi)藥物，化學(xué)名為4，5-二乙酰氧基 -9，10-二氫 -9，10-二氧代 -2蒽羧酸，主要活性代謝產(chǎn)物為大黃酸[1]，是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中參與重要炎性反應(yīng)的白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子-α的抑制劑[2-4]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，抑制軟骨降解及破骨細(xì)胞性骨破壞[5-8]的作用，用于治療退行性關(guān)節(jié)疾病（骨關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病），可顯著改善骨關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病引起的疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙等。為提高檢驗(yàn)效率，參照進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定雙醋瑞因膠囊有關(guān)物質(zhì)[9-12]，修訂系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求[13-16]，結(jié)果各雜質(zhì)出峰順序不因色譜柱及流動(dòng)相比例的改變而改變，且雜質(zhì)峰易分離，便于辨識(shí)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters E2695型高效液相色譜儀，含Empower工作站、Waters 2489型紫外檢測(cè)器(美國(guó) Waters公司）；MT-5型電子天平(百萬(wàn)分之一)、XS105 DualRange型電子天平(十萬(wàn)分之一)，均購(gòu)于瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試藥

樣品：雙醋瑞因膠囊(某企業(yè)，批號(hào)分別為 A，B，C)；峰識(shí)別對(duì)照品（某企業(yè)，批號(hào)為 371111，含量為100.5%，含雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸）；大黃酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 110757-200206，含量為 100.00%）；醋酸（分析純）；二甲基甲酰胺（DMF，99.8%，Merck 公司，色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

供試品溶液：避光操作，取裝量差異項(xiàng)下粉末，研細(xì)，取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于雙醋瑞因50 mg），精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加DMF 40 mL，超聲5 min，振搖使雙醋瑞因溶解，加DMF稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相乙腈-甲醇-醋酸溶液（20∶45∶35，V／V／V）稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得（臨用新制）。

對(duì)照品溶液：取大黃酸對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加DMF 10 mL溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照溶液與靈敏度試驗(yàn)溶液：避光操作，精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；精密量取對(duì)照溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度試驗(yàn)溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：醋酸溶液（取水1 000 mL，用醋酸調(diào)pH至2.5)-甲醇 -乙腈(35∶45∶20，V／V／V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按雙醋瑞因峰計(jì)應(yīng)不低于2 000。

取峰識(shí)別對(duì)照品適量，加DMF溶解并稀釋成每1 mL約含1 mg的溶液，精密量取，加流動(dòng)相稀釋成每1 mL含 10 μg的溶液，量取20 μL，注入液相色譜儀，精密量取靈敏度試驗(yàn)溶液20 μL，注入液相色譜儀，雙醋瑞因峰的信噪比大于10。再精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。各組分的出峰順序?yàn)殡p醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸，相對(duì)保留時(shí)間分別為 1.0，1.4，1.8，2.2 min（圖 1）。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取樣品粉末適量（相當(dāng)于含雙醋瑞因125 mg），精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞樣品貯備液。精密移取未破壞樣品貯備液2.0 mL共4份，分別置10 mL容量瓶中，分別進(jìn)行如下處理：加1 mol／L鹽酸溶液2.0 mL，室溫下放置 5 h后，加入 1 mol／L的氫氧化鈉溶液適量，使之成中性，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾(酸破壞)；加 1 mol／L 氫氧化鈉溶液 2.0 mL，室溫下放置30 min后，加入1 mol／L的鹽酸溶液適量，使之成中性，加流動(dòng)相稀釋至刻度(堿破壞)；加30%過(guò)氧化氫溶液2.0 mL，室溫下放置5 h后，加流動(dòng)相稀釋至刻度(氧化破壞)；放于光照強(qiáng)度為4 500 lx的實(shí)驗(yàn)箱中，室溫下放置24h后，加流動(dòng)相稀釋至刻度(光照破壞)。另外，取雙醋瑞因膠囊內(nèi)容物（約相當(dāng)于雙醋瑞因125 mg），精密稱(chēng)定，放于密封的耐高溫玻璃小瓶中，置80℃高溫6 h，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻(高溫破壞)。精密量取上述條件處理溶液5 mL，分別置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。詳見(jiàn)圖2。

圖2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

可見(jiàn)，酸、堿、氧化、光照、高溫破壞條件下降解產(chǎn)生的雜質(zhì)峰不干擾主成分峰，主成分峰均一，色譜峰純度大于990，峰純度符合要求，無(wú)雜質(zhì)峰與主成分一起洗脫。結(jié)果表明，雙醋瑞因在光照、堿性條件下降解較明顯，酸、高溫、氧化條件下較穩(wěn)定。樣品記錄色譜圖至3倍主峰保留時(shí)間后無(wú)超過(guò)0.05%限度的降解雜質(zhì)峰出現(xiàn)，在進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)樣品記錄色譜圖至3倍主峰保留時(shí)間是合適的。同時(shí)也表明，本方法可穩(wěn)定地檢測(cè)樣品所發(fā)生的降解變化，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

2.4 方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：取大黃酸對(duì)照品10.104 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加入DMF 10 mL使溶解，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為大黃酸線(xiàn)性考察溶液（2.02 μg ／mL）；分別量取該溶液適量，置適宜容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為 1.20，1.00，0.60，0.20，0.08，0.04 μg ／mL 的系列線(xiàn)性考察溶液。按擬訂色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程 A＝83 963 C-787.71，r＝0.999 9（n＝7）。結(jié)果表明，大黃酸質(zhì)量濃度在 0.04 ～2.02 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。取雙醋瑞因膠囊內(nèi)容物0.262 6 g（平均裝量每粒 0.246 31 g，含雙醋瑞因 50 mg），精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加DMF至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度；再取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為自身對(duì)照線(xiàn)性考察溶液（雙醋瑞因質(zhì)量濃度為 2.13 μg／mL），分別取該溶液適量，置容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為 1.07，0.64，0.53，0.32，0.11，0.04，0.02 μg／mL的自身對(duì)照系列線(xiàn)性考察溶液。按擬訂色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程 A＝6 110 430 C＋342.29，r＝1.000 0（n ＝8）。結(jié)果表明，雙醋瑞因質(zhì)量濃度在 0.02～2.13 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一大黃酸對(duì)照品溶液，每次進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果的 RSD為 0.21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）確定：經(jīng)試驗(yàn)，雙醋瑞因及大黃酸的最低 LOD（S／N ＝3）分別為 0.006 μg／mL和 0.017 μg／mL，LOQ（S ／N ＝ 10）分別為 0.02 μg／mL和 0.058 μg ／mL。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)C），分別于配置后的 0，2.5，6，17，19，33 h 時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，主成分峰峰面積變化不明顯，但單乙酰大黃酸Ⅰ和單乙酰大黃酸Ⅱ隨著時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積逐漸增加，在33 h時(shí)含量分別由0.08%增加至0.16%、由0.05%增加至0.10%，但未見(jiàn)其他雜質(zhì)峰增加，表明雙醋瑞因在DMF中穩(wěn)定性較差，應(yīng)臨用現(xiàn)配，立即用流動(dòng)相稀釋。

加樣回收試驗(yàn)：取大黃酸對(duì)照品約5 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備溶液。精密量取該貯備溶液1，2，3 mL（比例為50%，100%，150%），置加入相應(yīng)空白輔料的100 mL容量瓶中，每個(gè)濃度樣品溶液各制備3份，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算大黃酸含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃酸回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.5 樣品含量測(cè)定

按擬訂色譜條件，對(duì)3批樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，用自身對(duì)照法計(jì)算各有關(guān)物質(zhì)含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果(%)

3 討論

分別考察了3個(gè)不同廠(chǎng)家品牌的色譜柱Kromasil C18柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent HC-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），GL ODS-3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），主峰與已知雜質(zhì)分離度均大于 1.5，按雙醋瑞因峰計(jì)理論板數(shù)均大于3 000，表明本試驗(yàn)中選定的色譜條件下，各組分峰形分離較好，適用于不同品牌C18柱，耐用性較好，滿(mǎn)足檢驗(yàn)需求。

在“藥典在線(xiàn)”網(wǎng)上參照2010年版《印度藥典》，采用與本方法相同的Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為 0.2%磷酸溶液 -乙腈（62∶38，V／V），檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，流速為 1.0 mL／min，柱溫為 30℃，進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)得單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ、大黃酸的分離度分別為 2.273，2.383，1.151，分離度較高，結(jié)果與本方法基本一致。

為考察色譜條件的微小變化對(duì)各有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響程度，本試驗(yàn)考察了流動(dòng)相比例（醋酸水溶液 -甲醇 -乙腈 (30 ∶47.5 ∶22.5，V／V／V)即水相30% ，以及醋酸水溶液 -甲醇 -乙腈(40 ∶42.5 ∶17.5，V／V／V)即水相 40% 及 pH（±0.2)即 pH 2.3 及 pH 2.7的變化對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果差異不大（RSD＜2.0%），均未檢出其他最大單個(gè)未知雜質(zhì)峰，表明本試驗(yàn)中選定的色譜條件下，各組分峰形分離較好。

本研究中色譜條件采用醋酸溶液（取水1 000 mL，用醋酸調(diào)節(jié) pH 至 2.5）-甲醇 -乙腈（35∶45 ∶20，V／V／V）為流動(dòng)相，各雜質(zhì)的出峰順序不易因色譜柱及流動(dòng)相比例的改變而改變，在使用不同品牌C18柱時(shí)無(wú)差異，因此適用的色譜柱范圍較廣，避免因所用色譜柱柱效下降、分離度變差、已知雜質(zhì)可能發(fā)生色譜峰重疊、未知雜質(zhì)可能被誤認(rèn)為已知雜質(zhì)而導(dǎo)致雜質(zhì)誤判的情況。同時(shí)，修訂系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，用含雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸的峰識(shí)別對(duì)照品為參比物，以相對(duì)保留時(shí)間作為系統(tǒng)適用性的要求和峰識(shí)別依據(jù)，方法更清晰、明了；由于該系統(tǒng)條件運(yùn)行一針的時(shí)間短，能有效提高檢驗(yàn)效率。

綜上所述，本試驗(yàn)中建立的系統(tǒng)條件適用于雙醋瑞因膠囊有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，適用的色譜柱范圍較廣，各雜質(zhì)峰易分離，試驗(yàn)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。