肝郁證雌性大鼠乳腺組織癌前因子的表達(dá)及柴胡疏肝散的干預(yù)作用

錢夢， 謝鳴， 張媛鳳， 劉碧原， 李聰

（北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)系，北京 100029）

基于此，本研究擬建立肝郁證雌鼠模型，觀察該模型雌鼠乳腺組織的病理變化和癌前因子的表達(dá)及柴胡疏肝散的干預(yù)作用，為認(rèn)識中醫(yī)“肝郁”與女性乳腺病變關(guān)聯(lián)的內(nèi)涵（肝郁可能涉及女性乳腺癌前因子的異常表達(dá)）提供實驗依據(jù)，并探討柴胡疏肝散對防治肝郁證乳腺病的效用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物健康性成熟未孕Wistar雌鼠55只，9周齡，級別SPF/VAF，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2012-0001。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：光照節(jié)律12L∶12D（6∶00～18∶00）；室溫20～25℃；相對濕度（50±5）%。

1.2藥物柴胡疏肝散組成（按21世紀(jì)課程教材《方劑學(xué)》第2版）：柴胡6 g、陳皮6 g、川芎5 g、香附5 g、枳殼5 g、芍藥5 g、炙甘草3 g。以上藥物由北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司提供，藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉春生教授鑒定均為正品。采用水提醇沉法將藥物制成顆粒，每g顆粒含5 g生藥。使用前用蒸餾水配制成12.4%和3.1%濃度的藥液。

1.3試劑瑞士——姬姆薩復(fù)合染液（上海源葉生物科技有限公司，批號：R20659）；去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（批號：20170520.60075R）、5-羥色胺（5-HT）ELISA檢測試劑盒（批號：20170520.60087R）、多巴胺（DA）ELISA檢測試劑盒（批號：20170520.60088R）；腎上腺素（E）ELISA檢測試劑盒（批號：20170520.60082R）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）ELISA檢測試劑盒（批號：20170629.60045R）、生存素（Survivin）ELISA檢測試劑盒（批號：20170629.60391R）、三葉因子1（TFF1）ELISA檢測試劑盒（批號：20170629.60422R）、三葉因子3（TFF3）ELISA 檢測試劑盒（批號：20170629.60423R）等均由北京瑞格博生物技術(shù)有限公司提供；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）放射免疫測定試劑盒（批號：20161111）、皮質(zhì)酮/腎上腺酮（CORT）放射免疫測定試劑盒（批號：20161116）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）放射免疫測定試劑盒（批號：20161118）等均由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.4儀器自制束縛筒為有機玻璃制成的圓筒狀結(jié)構(gòu)，主筒長25 cm，筒口外徑7 cm，內(nèi)徑5 cm；前端置有一直徑小于主筒的、可以前后調(diào)節(jié)的帶有透氣孔的、便于大鼠頭伸進(jìn)的有機玻璃前罩，后端為可調(diào)節(jié)間距的開關(guān)閥門。Olympus-IX71光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動生化分析儀（美國Beckmancoulter公司）；Thermo Multiskan MK7全自動酶標(biāo)儀[Thermo（原芬蘭雷勃）公司]。

1.5造模方法參考文獻(xiàn)[4]采用慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型：將大鼠放入有機玻璃束縛裝置中，每天束縛3 h（AM 8∶00-11∶00），連續(xù)造模28 d。

提高課堂效率，教師的主導(dǎo)作用不能“矮化”。在實驗中，我發(fā)現(xiàn)教師“教什么”比“怎么教”更為重要。許多教師不學(xué)習(xí)課程標(biāo)準(zhǔn)，不鉆研教材，自己站位不高，所以對學(xué)生的引導(dǎo)也很膚淺。于是，我創(chuàng)立了中小學(xué)教師“說課標(biāo)說教材”演講活動，引導(dǎo)廣大中小學(xué)教師“高站位把握課標(biāo)，立體式駕馭教材”。

1.6分組處理健康雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，進(jìn)行為期5 d的雌鼠陰道涂片的制備，篩除動情周期不穩(wěn)定的雌鼠。將合格的40只大鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（30只）。造模組雌鼠按上述方法造模14 d后，隨機分為模型組、柴胡疏肝散大劑量組（簡稱“柴大組”）和柴胡疏肝散小劑量組（簡稱“柴小組”），每組10只。柴胡疏肝散大、小劑量均按成人用量（0.62 g/kg）的2倍、0.5倍量設(shè)定。柴大組、柴小組分別按1.24、0.31 g·kg-1·d-1給予中藥湯液灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。正常組及模型組給予等量蒸餾水。于造模第27天制備各組大鼠陰道涂片觀察動情周期情況，選擇動情前期/動情間期（實驗第28～30天）處殺取材，測定各項指標(biāo)。

1.7指標(biāo)檢測與方法

1.7.1 中醫(yī)外觀行為學(xué)指標(biāo) 于實驗進(jìn)行的每周一和周五觀測并記錄各組大鼠的一般外觀行為（行為狀態(tài)、活躍程度、情緒反應(yīng)、睡眠狀態(tài)）的變化，并給予評分。外觀行為的各項評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[5]。統(tǒng)計每周各組大鼠外觀行為各項變化的積分，取每周2次觀測的均值。最后將性質(zhì)相近的外觀表征合并為2個指標(biāo)群（活動狀態(tài)、情緒睡眠），并分別統(tǒng)計各指標(biāo)群的積分。

1.7.2 乳腺病理觀察 （1）制片操作步驟：①脫水，乳腺組織采用50%乙醇溶液→70%乙醇溶液→80%乙醇溶液→90%乙醇溶液→95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1.5 h梯度脫水；②透明，乳腺組織采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min；③浸蠟，乳腺組織浸蠟Ⅰ、Ⅱ各60 min；④包埋，將融化的石蠟導(dǎo)入包埋盒內(nèi)，用加溫鑷子將浸蠟的乳腺組織迅速放入包埋盒，包埋溫度為60～62℃，形成長方形石蠟塊。（2）蘇木素——伊紅（HE）染色操作步驟：①石蠟切片置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各10 min；②無水乙醇Ⅰ、Ⅱ→95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ→90%乙醇溶液→80%乙醇溶液→70%乙醇溶液，各5 min；③蒸餾水浸泡5 min；④蘇木素染液浸泡15 min；⑤流動水沖洗5 min；⑥0.5%鹽酸酒精分化30 s；⑦1%伊紅染液浸泡10 min；⑧流動水沖洗1 min；⑨梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；⑩中性樹脂封膠片。（3）光鏡觀察：參考文獻(xiàn)[6，7]對乳腺增生病理變化進(jìn)行觀察及描述。

1.7.3 ELISA法檢測 采用ELISA法檢測血漿5-HT、DA、E、NE，血清TFF1、TFF3及乳腺組織Survivin、TIMP-2含量，具體步驟按照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7.4 放射免疫法檢測 采用放射免疫法檢測血清ACTH、CORT及下丘腦CRH含量，具體步驟按照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有圖表均用Graph Pad Prism 7軟件制作。

2 結(jié)果

2.1柴胡疏肝散對雌性肝郁證大鼠中醫(yī)證候的影響

2.1.1 各組大鼠一般外觀行為學(xué)的變化 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠第1～4周活動狀態(tài)積分均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴大組第3、4周活動狀態(tài)積分明顯降低（P＜0.01），柴小組第3、4周活動狀態(tài)積分有降低趨勢（P＞0.05）。表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠第1周情緒睡眠評分未見明顯變化（P＞0.05），第2～4周情緒睡眠評分均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴大組第3、4周情緒睡眠評分明顯降低（P＜0.01），柴小組第3、4周情緒睡眠積分有降低趨勢（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點活動狀態(tài)的積分變化比較Table 1 Comparison of the integral changes of activity status of rats in various groups at different time points （-x±s，s/分）

表2 各組大鼠不同時間點情緒睡眠的積分變化比較Table 2 Comparison of the integral changes of emotion and sleep in various groups at different time points （-x±s，s/分）

2.1.2 各組大鼠肝郁證候?qū)嶒炇抑笜?biāo)的變化

2.1.2.1 單胺類遞質(zhì)的變化 表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血中5-HT、NE、DA含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），E含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴大組大鼠血中5-HT、NE含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），柴小組大鼠血中NE、DA含量明顯升高（P＜0.01）。

2.1.2.2 腎上腺皮質(zhì)軸的變化 表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠下丘腦CRH、血清ACTH和CORT表達(dá)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，柴大組大鼠下丘腦CRH、血清ACTH和CORT表達(dá)明顯降低（P＜0.01），柴小組大鼠血清CORT表達(dá)降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血漿單胺類遞質(zhì)的變化比較Table 3 Comparison of the changes of plasma monoamine transmitters in various groups (-x±s)

表4 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)軸的變化比較Table 4 Comparison of the changes of adrenalaxis indexes in various groups (-x±s)

2.2雌性肝郁證大鼠乳腺組織的變化及柴胡疏肝散的作用

2.2.1 各組大鼠乳腺病理的變化 圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠乳腺腺泡形狀規(guī)則，腺導(dǎo)管管腔無擴(kuò)張，腺泡和導(dǎo)管內(nèi)無分泌物（圖1-a）；與正常組比較，模型組大鼠乳腺腺泡形狀不規(guī)則，腺導(dǎo)管管腔擴(kuò)張，導(dǎo)管內(nèi)分泌物增加（圖1-b）；與模型組比較，柴大組大鼠乳腺腺泡形狀趨于規(guī)則，但仍伴有不規(guī)則腺泡，導(dǎo)管內(nèi)分泌物減少（圖1-c），柴小組大鼠乳腺腺泡趨于規(guī)則，但以不規(guī)則腺泡居多（圖1-d）。

圖1 各組大鼠乳腺病理的變化（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphologic changes of mammary gland tissues in various groups（by HE staining，×200）

2.2.2 各組大鼠癌前因子的表達(dá) 表5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠乳腺Survivin和TIMP-2含量明顯升高（P＜0.01），血清TFF1、TFF3含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴大組大鼠乳腺Survivin和TIMP-2含量均明顯降低（P＜0.01），柴小組TIMP-2含量明顯降低（P＜0.01）。

表5 各組大鼠癌前因子的表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression levels of precancerous factors in various groups (-x±s)

3 討論

3.1肝郁證模型的復(fù)制肝郁證動物模型的建立目前主要有藥物注射、慢性應(yīng)激、情志刺激及復(fù)合造模等幾種方法[8]，其中束縛法通過限制大鼠的活動，使其所欲活動不遂而發(fā)為肝郁，比較符合中醫(yī)肝郁證的發(fā)病機制，是目前肝郁證動物模型建立的常用方法。對中醫(yī)證候模型的判斷方法包括中醫(yī)證候表現(xiàn)、實驗室指標(biāo)及藥物反證法[8]，而現(xiàn)階段肝郁證模型的判斷多采用證候標(biāo)準(zhǔn)[9-11]，主要包括模型動物在情緒、反應(yīng)、食寐和大便等方面的改變，兼以單胺類遞質(zhì)和腎上腺皮質(zhì)軸相關(guān)激素的變化作為佐證[12-14]。有研究采用慢性束縛應(yīng)激法建立肝郁證大鼠模型3周[15]或4周[16]，觀察到模型大鼠由最初情緒暴躁逐漸轉(zhuǎn)為情緒低落，血漿ACTH和CORT含量明顯增高，海馬組織內(nèi)5-HT、NA及DA均顯著降低[17]。目前有關(guān)雌性肝郁證大鼠模型的研究不多，既往曾有將雌鼠用戊巴比妥麻醉后帶枷聯(lián)合單籠飼養(yǎng)法復(fù)制肝郁證模型，結(jié)果顯示模型雌鼠表現(xiàn)出煩躁不安、易激惹轉(zhuǎn)變?yōu)榫裎摇⒕肱P少動[18]。另有用紗布束縛四肢并將雌鼠置于束縛筒內(nèi)連續(xù)7 d[19]和采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激法21 d[20]建立肝郁證雌鼠模型的研究，結(jié)果顯示模型雌鼠腦干DA、5-HT表達(dá)明顯增加，血清NE含量升高。提示中醫(yī)肝郁證存在中樞及外周單胺類遞質(zhì)的紊亂和腎上腺皮質(zhì)軸功能的亢進(jìn)。

本課題組既往采用慢性束縛應(yīng)激法成功復(fù)制出雄性大鼠肝郁證模型[21]。本研究也觀察到，雌鼠慢性束縛2周后開始出現(xiàn)多動、情緒不穩(wěn)等表現(xiàn)，后逐漸轉(zhuǎn)為神情抑郁、活動減弱、反應(yīng)遲緩等類似中醫(yī)肝郁證的表現(xiàn)，外觀變化積分顯著高于正常組。束縛4周的雌鼠血中5-HT、NE及DA明顯降低，下丘腦CRH、血中ACTH、CORT及E明顯升高。表明該法誘導(dǎo)的雌鼠也存在腎上腺皮質(zhì)軸的功能亢進(jìn)和單胺類遞質(zhì)及交感神經(jīng)功能的紊亂，該模型具有較好的可重復(fù)性，且不受性別的影響。

3.2肝郁證雌性大鼠乳腺的病理變化乳腺增生是一種既非炎癥又非腫瘤的病變，其因末端乳管和腺泡上皮的增生和脫落，乳管膨脹而發(fā)生臨床疼痛，病理過程則以腺體小葉和乳腺導(dǎo)管末梢擴(kuò)張、增生和囊性改變?yōu)橹鳌Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，激素可以誘導(dǎo)出大鼠乳腺增生癥，如給予大鼠雌二醇[22]或雌二醇+黃體酮[23]注射30 d，均可引起模型大鼠乳腺腺泡和導(dǎo)管大量增生、小葉內(nèi)腺泡聚集并大小不等、腺泡腔擴(kuò)大及導(dǎo)管擴(kuò)張、導(dǎo)管腔內(nèi)出現(xiàn)大量分泌物等改變。本研究給予大鼠束縛4周，結(jié)果顯示大鼠不僅表現(xiàn)出中醫(yī)肝郁證相關(guān)指標(biāo)的變化，且乳腺組織出現(xiàn)腺泡形狀不規(guī)則、腺導(dǎo)管管腔擴(kuò)張、腺泡和導(dǎo)管內(nèi)分泌物增加等變化，表明該肝郁證雌鼠伴有乳腺增生樣改變。

3.3肝郁證雌性大鼠乳腺癌前因子的變化存活素（Survivin）是凋亡蛋白抑制因子家族的一員，與腫瘤的增殖、血管生成等有著密切的關(guān)系，在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[24]，屬于促癌因子。臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者乳腺組織內(nèi)Survivin的水平均明顯高于乳腺纖維瘤患者[25]和正常乳腺組織[26]。應(yīng)用甲基亞硝基脲誘導(dǎo)9周的乳腺癌大鼠模型乳腺組織內(nèi)的Survivin水平明顯高于正常組[27]。本研究觀察到，束縛4周的模型雌鼠乳腺組織Survivin表達(dá)明顯升高，提示該模型大鼠存在促癌因子的過度表達(dá)、乳腺增生樣變存在過度增殖的潛在風(fēng)險。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族成員主要通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）則可有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，前者屬于促癌因子，后者屬于抑癌因子，二者處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)其平衡狀態(tài)被打破則會導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)過度降解，誘發(fā)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。臨床研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2在包括乳腺癌[28]在內(nèi)的多種惡性腫瘤[29-31]中呈高表達(dá)；實驗研究亦顯示，乳腺癌小鼠模型乳腺組織內(nèi)TIMP-2的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織[32]。因此，國內(nèi)外有學(xué)者[33]認(rèn)為TIMP-2在腫瘤組織內(nèi)的升高是對MMP家族成員高表達(dá)反饋的結(jié)果。本研究觀察到束縛4周的模型雌鼠乳腺組織內(nèi)TIMP-2明顯升高，提示肝郁證模型雌鼠乳腺組織內(nèi)可能存在抑癌反饋機制的激活。

近年來的研究表明，TFF1和TFF3為抑癌因子[34]，具有腫瘤抑制、胃腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)等生物功能[35-37]；但TFF1和TFF3同時與血管生成、細(xì)胞遷移、增殖等作用相關(guān)，因此也有認(rèn)為其具有促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[38]。目前有關(guān)TFF1與TFF3對于癌腫的影響尚存在分歧。臨床研究曾發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清TFF1[39]和TFF3表達(dá)較健康對照組明顯升高，56.5%的乳腺癌患者TFF1表達(dá)陽性，73.9%的乳腺癌患者TFF3表達(dá)陽性[40]。而在胃癌與TFF1的關(guān)系研究中表明，TFF1在正常胃黏膜中表達(dá)最高，在上皮不典型增生至胃癌發(fā)展中逐漸下降[41]，因此有學(xué)者認(rèn)為TFF1的表達(dá)降低是胃癌發(fā)展過程中的早期事件[42]，提示TFF1表達(dá)降低可能與早期癌變存在聯(lián)系。本研究觀察到，束縛4周的模型雌鼠血清TFF1和TFF3表達(dá)較正常組降低。但其與該模型乳腺增生之間是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

3.4柴胡疏肝散對模型大鼠肝郁證的影響本研究觀察了肝郁證的因證治方——柴胡疏肝散對該模型下雌鼠肝郁證候的影響。結(jié)果顯示，柴胡疏肝散大劑量可使模型大鼠的活動狀態(tài)、情緒睡眠等外觀表征積分降低，小劑量對積分有降低趨勢。柴胡疏肝散大劑量可顯著降低模型雌鼠下丘腦高表達(dá)的CRH、血中高表達(dá)的ACTH和CORT水平，明顯升高血中降低的5-HT和NE水平，對血中的E及DA也有一定的反轉(zhuǎn)趨勢；小劑量可顯著降低模型雌鼠血中升高的CORT、升高其血中降低的NE及DA，對CRH、ACTH、5-HT和E的紊亂無明顯的調(diào)節(jié)作用。表明柴胡舒肝散有改善肝郁證模型大鼠的外觀表征和相關(guān)實驗室指標(biāo)的作用，大劑量作用優(yōu)于小劑量。

3.5柴胡疏肝散對模型大鼠乳腺及其癌前因子的作用本研究結(jié)果顯示，模型大鼠給予大、小劑量柴胡疏肝散2周后，模型雌鼠乳腺組織腺泡形狀趨于正常、腺泡及導(dǎo)管內(nèi)分泌物減少。表明柴胡疏肝散具有減輕肝郁證模型大鼠乳腺增生樣變的作用，其中大劑量療效優(yōu)于小劑量。本研究還觀察到，柴胡疏肝散可使模型大鼠乳腺內(nèi)升高的存活素和TIMP-2明顯降低，血清TFF1和TFF3呈現(xiàn)升高趨勢，提示其有下調(diào)模型雌鼠乳腺促癌因子的表達(dá)、抑制乳腺增生樣變進(jìn)一步發(fā)展為過度增殖、促進(jìn)抑癌因子的表達(dá)、激活抑癌反饋機制而具有潛在防癌作用。

綜上所述，慢性束縛法復(fù)制的肝郁證模型雌性大鼠呈現(xiàn)中醫(yī)證候相關(guān)的外觀行為和實驗室指標(biāo)的改變，并伴有乳腺增生樣變，乳腺組織伴有相關(guān)癌前因子表達(dá)的異常，提示肝郁證乳腺增生可能存在癌前病變的分子機制。柴胡疏肝散不僅對肝郁證雌性大鼠的中醫(yī)證候和實驗室指標(biāo)具有較好的改善作用，而且對模型大鼠的乳腺增生也有一定的抑制作用，其在緩減模型大鼠乳腺增生的同時，還可調(diào)節(jié)模型大鼠乳腺促癌/抑癌因子的表達(dá)。

本研究對于豐富“肝郁”與女性乳腺增生及癌前病變相關(guān)提供了一定的病理生理學(xué)及分子層面上的理解，為認(rèn)識柴胡疏肝散可能具有潛在的防癌效用提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)。