丹皮酚抑制大鼠肝缺血再灌注損傷中性粒細胞浸潤及TNF-α釋放

劉湘鈺， 劉寬智， 張新建

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510378；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510080）

肝切除、肝移植、出血性休克或嚴重膿毒癥等可造成肝缺血再灌注損傷，進而引發(fā)肝功能障礙或衰竭[1]。缺血狀態(tài)可造成肝細胞供氧不足及能量中斷，進而導(dǎo)致細胞死亡。此外，缺血狀態(tài)下產(chǎn)生大量的活性氧成分以及炎癥介質(zhì)均可造成再灌注過程中細胞凋亡和肝功能障礙[2，3]。目前，對于肝缺血再灌注損傷的治療以支持治療為主，尚無具體針對性的治療方法。丹皮酚（Paeonole）是中藥丹皮的主要活性成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、促進微循環(huán)等藥理作用[4-10]。既往研究表明丹皮酚對腦缺血再灌注損傷有修復(fù)作用[9，10]。本研究擬通過復(fù)制大鼠肝缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用丹皮酚干預(yù)，進一步觀察其對大鼠肝缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)的影響，以探討丹皮酚對大鼠肝缺血再灌注損傷的防治作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物24只3月齡健康SPF級SD雄性大鼠，購自中山大學(xué)動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號：SYXK（粵）2017-0081。全部動物飼養(yǎng)于中山大學(xué)動物實驗中心SPF級實驗室。實驗期間動物自由飲水，進食標準顆粒飼料。

1.2藥品、試劑與儀器丹皮酚（北京普天同創(chuàng)生物科技公司，純度99%，批號：17050910）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（深圳子科生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（碧云天科技有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國Cayman公司）；TRIzol（美國MRC公司，批號：TR118-500）；M-MLV Reverse Transcriptase（上海Promega 公 司 ， 批 號 ： M1705）； GoTaq?qPCR Master Mix（上海Promega公司，批號：A6002）。全自動生化分析儀（美國Johnson公司）；TGL-16R冷凍高速離心機（上海Hema公司）；XK-400手掌離心機（新莊醫(yī)療器械）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Hema9600基因擴增儀（上海Hema公司）；MiniOpticon Real-time Quantitative PCR（美國Bio-Rad公司）；UV-752P紫外可見分光光度計（上海奧譜勒儀器）。

1.3大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型的復(fù)制方法大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水，依據(jù)文獻[11]報道的方法復(fù)制肝臟缺血再灌注損傷模型。操作方法：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒。沿腹部中線打開腹腔，分離肝臟周圍組織，暴露肝門，用小號動脈夾阻斷左、中葉肝蒂，完全阻斷左、中葉肝臟血流，造成受累肝葉完全缺血，保留肝右葉、尾狀葉（約占全肝30%）血供。阻斷60 min后去除肝蒂阻斷夾，恢復(fù)肝臟灌流。

1.4實驗動物分組、造模與給藥將SD大鼠隨機分成3組，即假手術(shù)組、模型組、丹皮酚組，每組8只。假手術(shù)組：僅暴露肝門，不夾閉動、靜脈。模型組：復(fù)制肝缺血再灌注損傷模型，于阻斷前30 min和開放后10 min分別靜脈注射與丹皮酚組等容量的生理鹽水。丹皮酚組：復(fù)制肝缺血再灌注損傷模型，夾閉左、中葉肝蒂60 min后恢復(fù)灌注，再灌注24 h后取材。依據(jù)文獻[8]報道，相比對照組，丹皮酚在低劑量（5 mg/kg）以上時，對組織缺血再灌注有顯著的保護作用，因此本研究中，丹皮酚劑量擬定為5 mg/kg，于阻斷前30 min和開放后10 min分別腹腔注射給藥。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 血清ALT、AST檢測 于再灌注后24 h抽取大鼠下腔靜脈血樣，4℃3 000 r/min離心5 min，取上層血清并保存于-80℃冰箱中備用。按操作說明使用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平。

1.5.2 病理學(xué)觀察 取大鼠肝左前葉組織，用10%中性甲醛固定，常規(guī)石醋包埋、切片，蘇木素——伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

1.5.3 血清TNF-α含量檢測 于再灌注后24 h抽取大鼠下腔靜脈血樣，4℃3 000 r/min離心5 min，取上層血清并保存于-80℃冰箱中備用。采用ELISA法檢測血清TNF-α的水平，應(yīng)用酶標儀檢測，在波長450 nm處取其吸光度（OD）值。具體操作步驟按試劑說明書進行。

1.5.4 肝組織TNF-α mRNA表達水平檢測 再灌注后24 h處死各組大鼠并取出部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中備用。逆轉(zhuǎn)錄采用聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測TNF-α mRNA表達水平。按照TRIzol說明書提取肝組織總RNA。取1 mg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。TNF-α引物由上海生工合成。TNF-α上游引物序列為5’-CACCACGCTCTTCTGT C-3’，下游5’-CTACGGGCTTGTCACTC-3’，擴增片段為146 bp。采用Real-time Quantitative PCR儀，擴增條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59℃退火30 s，共進行40個循環(huán)。以樣本Ct值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算。

1.5.5 肝組織MPO活性檢測 再灌注后24 h處死各組大鼠并取出部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中備用。生理鹽水清洗后上自動勻漿機制成勻漿，3 000 r/min離心15 min取上清液。采用ELISA法檢測肝組織MPO活性，應(yīng)用酶標儀檢測，取其在波長450 nm處的OD值。具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，多組比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹皮酚對肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT、AST的影響表1結(jié)果顯示：3組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠血清ALT、AST水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 丹皮酚對肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT、AST的影響Table 1 The effect of paeonol on the serum levels of ALT and AST in hepatic ischemia-reperfusion injury rats[-x±s，J/（U·L-1）]

2.2丹皮酚對缺血再灌注損傷大鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)的影響圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組可見肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，未見細胞變性等病理變化。與假手術(shù)組比較，模型組中肝細胞廣泛壞死，并可見細胞腫脹、細胞核碎裂以及胞質(zhì)空泡樣變等病理表現(xiàn)。而丹皮酚組可見肝細胞大部分保持清晰的結(jié)構(gòu)，細胞排列雖可見部分紊亂，但是細胞壞死、腫脹以及空泡樣變等病理現(xiàn)象少見。

圖1 各組大鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological features of liver tissue in various groups（by HE staining，×200）

表2 各組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達水平比較Table 2 Comparison of the serum TNF-α content and the expression level of TNF-α mRNA in hepatic tissue of various groups (-x±s)

2.3丹皮酚對肝缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達水平的影響表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示丹皮酚可減輕大鼠肝缺血再灌注損傷時TNF-α的釋放。

2.4丹皮酚對缺血再灌注損傷大鼠肝組織MPO活性的影響表3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織MPO活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠肝組織MPO活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示丹皮酚可減輕肝缺血再灌注損傷模型大鼠肝組織中性粒細胞的浸潤程度。

表3 各組大鼠肝組織MPO活性比較Table 3 Comparison of the MPO activity in hepatic tissue of various groups (-x±s)

3 討論

本研究結(jié)果顯示肝缺血再灌注損傷造模大鼠血清ALT、AST升高，并見肝細胞腫脹、壞死、核裂解等病理損傷，表明大鼠肝缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功。

肝缺血再灌注損傷是肝臟手術(shù)和移植術(shù)后的并發(fā)癥，常可引起肝功能不全，是導(dǎo)致肝臟手術(shù)和肝臟移植手術(shù)失敗或患者死亡的主要原因之一[12]。肝缺血再灌注損傷的過程復(fù)雜，有許多細胞和生物分子通過各種通路參與其中，包括肝細胞厭氧代謝、線粒體損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、肝細胞內(nèi)Ca2+超載、細胞因子、趨化因子以及中性粒細胞等[13，14]。

在肝缺血再灌注損傷中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，其中中性粒細胞浸潤常常是造成組織損傷加重的重要因素之一，因此，通過減少或控制中性粒細胞浸潤的治療有可能是有效的應(yīng)對措施[15]。當(dāng)肝缺血再灌注損傷發(fā)生時，細胞因子和趨化因子可以激活中性粒細胞并將其聚集到肝臟缺血部位，大量浸潤的中性粒細胞通過釋放炎性介質(zhì)、細胞毒產(chǎn)物、氧自由基等來引起一系列病理反應(yīng)，從而造成肝細胞損傷和壞死，進而造成肝功能障礙等。王萬鐵等[16]研究表明在家兔肝缺血再灌注損傷模型中，隨著缺血再灌注時間延長，肝組織中的中性粒細胞聚集程度加重，同時也伴隨著肝細胞病理變化加劇。MPO是中性粒細胞募集和活化后釋放的主要分子之一，其在中性粒細胞中高表達，是中性粒細胞的標記物，其活性與組織中性粒細胞的浸潤程度有關(guān)，并參與肝缺血再灌注損傷的病理生理反應(yīng)的過程[17]。Kato等[18]在小鼠肝缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)MPO活性增加和中性粒細胞浸潤增加與肝細胞壞死相一致。本研究結(jié)果顯示大鼠肝缺血再灌注肝組織MPO活性明顯上升，這提示存在中性粒細胞大量浸潤。

TNF-α是一個具有多種效應(yīng)的細胞因子，既可以誘導(dǎo)細胞增殖、代謝活化，也可以促進炎癥反應(yīng)甚至引發(fā)細胞死亡[19]。當(dāng)發(fā)生肝缺血再灌注損傷時，肝臟中的Kupffer細胞在再灌注過程中發(fā)揮著核心作用，其主要通過再灌注早期釋放大量活性氧分子（Reactive oxygen species，ROS）來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及釋放大量促炎癥細胞因子引起炎癥反應(yīng)來直接殺傷組織[20]。TNF-α作為Kupffer細胞釋放的促炎癥因子之一，對炎癥級聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)起著重要作用。研究[21]表明TNF-α可通過與肝細胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生大量上皮嗜中性粒細胞趨化因子，活化ROS、NF-κB以及促分裂原活化蛋白激酶等來直接殺傷肝細胞。另外，TNF-α可促進細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecules 1，VCAM1）及 P選擇素等黏附分子的表達，這些黏附分子大量聚集可激活中性粒細胞并使之進入肝臟缺血組織，從而損傷肝細胞。本研究結(jié)果顯示大鼠肝缺血再灌注24 h后血清TNF-α及肝臟組織TNF-α均顯著升高，提示TNF-α參與了肝缺血再灌注損傷的過程。

丹皮酚作為預(yù)防肝缺血再灌注損傷的熱點藥物，本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，丹皮酚組血清ALT、AST，血清TNF-α、肝組織TNF-α表達水平及MPO活性明顯降低，肝細胞壞死、病理性損傷明顯減輕。提示丹皮酚預(yù)處理可減輕肝缺血再灌注損傷，具有保護作用。其中，經(jīng)丹皮酚預(yù)處理后MPO活性顯著降低（P＜0.05）的結(jié)果，亦提示丹皮酚可以通過減少肝組織中中性粒細胞浸潤來減輕炎癥反應(yīng)，進而保護受損的肝臟組織。經(jīng)丹皮酚預(yù)處理后大鼠血清TNF-α及肝組織TNF-α較模型組顯著下降（P＜0.05）的結(jié)果，亦提示丹皮酚預(yù)處理可以減少TNF-α的生成、釋放以及其隨后帶來的炎性反應(yīng)，實現(xiàn)對肝臟組織的保護作用，其發(fā)揮作用的分子機制可能與抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，丹皮酚能減輕大鼠肝缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制中性粒細胞浸潤，減輕炎癥因子TNF-α的釋放有關(guān)。