血府逐瘀湯加減方對冠心病心血瘀阻證患者血漿小分子代謝產物的影響及機制研究

鄭娟娟，郭佳和，馬國斌，林旭輝，張統文，鄭伯仁

（廈門大學附屬福州第二醫院，福建 福州 350007）

冠心病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病［1］，嚴重危害人類健康。相對于藥物長期服用后的毒副作用、介入治療昂貴的費用和手術風險，中醫藥治療顯現出獨特的優勢，已成為冠心病治療中的一種新選擇。本課題選用血府逐瘀湯加減方治療冠心病心血瘀阻證患者，運用氣相色譜-飛行時間質譜（GC-TOF-MS）聯用技術［2］檢測其治療前后血漿小分子代謝產物的變化，研究冠心病心血瘀阻證的相關代謝途徑以及其可能的作用機制，為中醫藥防治冠心病提供客觀、科學的理論依據。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 西醫診斷標準根據WH0制定的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》［3］，中醫辨證標準參考《中醫病證診斷療效標準》［4］辨為心血瘀阻證。

1.2 納入標準 ① 年齡 35～80歲；② 符合西醫診斷標準及中醫辨證標準的穩定期患者；③ 經醫院倫理委員會批準并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 ① 急性冠脈綜合征；② 心肌炎；③ 非缺血性心臟病（慢性肺源性心臟病、貧血性心臟病、風濕性心臟病等）；④ 繼發性高血壓和不能控制的惡性高血壓；⑤ 其他疾病引起的心絞痛；⑥糖尿病；⑦ 嚴重的肝腎功能障礙；⑧ 精神疾病；⑨惡性腫瘤等。

1.4 一般資料 選擇2017年3月—2019年3月首次在我院心內科經冠狀動脈造影術確診的冠心病、并經主任中醫師辨證為心血瘀阻證患者40例，采用隨機數字表法分成治療組22例和對照組18例，40例患者抽取隨機數0～9，隨機數除以2余數為1分入治療組，余數為0分入對照組。2組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表 1。

表1 2組一般資料比較（）

表1 2組一般資料比較（）

組別治療組對照組n 男22 18年齡／歲58.94±9.51 57.39±9.33病程＜6個月10 10病程＞6個月12 8 13 9女 9 9 BMI／（kg／m2）23.85±4.13 24.22±3.944 TC／（mmol／L）4.56±1.07 4.31±0.97 TG／（mmol／L）1.25±0.8 1.41±0.80 HDL-C／（mmol／L）1.17±0.44 1.06±0.36 LDL-C／（mmol／L）3.02±0.97 2.74±0.84 UA／（μmol／L）272.32±64.69 300.31±85.83

1.5 治療方法 ① 對照組采用西醫規范治療方案［5］（雙聯抗血小板、調脂穩定斑塊）：阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥保健有限公司，規格：0.1 mg×30片，生產批號：BJ18155），每次 0.1 g，每日 1次；硫酸氫氯吡格雷片［賽諾菲（杭州）制藥有限公司，規格：75 mg×7 片，生產批號：8A392］，每次 75 mg，每日1次；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，規格：20 mg×7 片，生產批號：75837102），每次 20 mg，每日1次。② 治療組采用西醫規范治療方案合血府逐瘀湯加減方口服，血府逐瘀湯加減方組成：生地黃10 g，桃仁 10 g，紅花 10 g，紫丹參 20 g，赤芍 10 g，川牛膝 10 g，當歸 10 g，川芎 10 g，柴胡 6 g，枳殼10 g，桔梗10 g。中藥由我院中藥房代煎，日服1劑，每次200 mL，分2次溫服。2組均治療30 d后判定療效。

1.6 觀察指標及檢測方法 2組患者治療前后在清晨空腹狀態下分別取血3 mL，保存于肝素鈉抗凝管中，經離心機4 000 r／min離心10 min即刻取上清，放置在冰柜中保存，溫度調節至-80℃。

運用GC-TOF-MS技術檢測其治療前后血漿小分子代謝產物的變化。GC-TOF-MS技術檢測由上海百趣生物醫學科技有限公司提供，氣相色譜儀器由安捷倫科技公司生產，型號：7890A，質譜儀品牌由美國力可分析儀器公司生產，型號：PEGASUS HT。使用 MS-DIAL軟件［6］對質譜數據進行分析，在物質定性工作中，使用了FiehnBinbase數據庫，包括質譜匹配及保留時間指數匹配。所得的數據輸出保存于Excel文件中。

1.7 數據分析 原始數據通過Excel編輯整理，將數據導入SIMCA 14.1軟件進行多元統計分析［7］。對所得的數據采用平均中心化（mean centering）進行預處理，處理后的數據采用主成分分析法（PCA）［8］，應用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）［9］的統計方法對結果進行分析，分析結果用散點圖（score scatter plot）的形式表示。計量資料符合正態分布的以（）描述，不符合正態分布的以中位數和四分位數間距（M±QR）描述；符合正態分布的采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的采用秩和檢驗，計數資料采用χ2檢驗，分別比較組間均值是否存在差異。

2 結 果

采用PCA分析法對2組治療前后共4組的血漿小分子代謝產物數據進行分析，繪制出反映組間離散程度的散點圖。

通過數據分析，建立數學模型，得到用于評價模型質量的指標：隱性變量反映自變量X的變異百分比［R2X（cum）］、隱性變量反映因變量Y的變異百分比［R2Y（cum）］和隱性變量用于預測X和 Y的百分比［Q2（cum）］。

2.1 PCA分析結果 2組治療前后PCA分析結果見圖1、圖2。從散點圖可見治療組治療前后樣本分開明顯，對照組治療前后樣本分開不明顯。

2.2 OPLS-DA分析結果 2組治療前后OPLS-DA分析結果見圖3、圖4。從散點圖可見：治療組治療前與治療后可以顯著區分，表明治療前后兩組樣本的血漿小分子代謝產物存在一定差異，R2X（cum）＝15.1%，R2Y（cum）＝70.3%，Q2（cum）＝70.3%；對照組治療前后2組區分不顯著，R2X（cum）＝34%，R2Y（cum）＝76.5%，Q2（cum）＝42.8%。

圖1 治療組治療前后GC-TOF-MS數據的PCA分析

圖2 對照組治療前后GC-TOF-MS數據的PCA分析

圖3 治療組治療前后GC-TOF-MS數據的OPLS-DA分析

2.3 差異性代謝產物的識別與篩選 治療組治療后丙酮酸、磷酸甲酯、2-羥基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸較治療前顯著下降，膽固醇較治療前顯著升高，見表2。對照組治療前后膽固醇、丙酮酸、磷酸甲酯、2-羥基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸改變無明顯差異，見表3。

圖4 對照組治療前后GC-TOF-MS數據的OPLS-DA分析

3 討 論

祖國醫學強調運用整體觀探討疾病發展的病因、病機及證治規律，調節整體平衡、把握動態變化是祖國醫學的基本治療原則，而代謝組學也強調把人體看成一個整體來研究，同時人體內的代謝產物也是動態變化的，代謝組學通過人體內代謝產物的變化，可以觀察疾病發生、發展的基本規律［10］，這與祖國醫學具有異曲同工之處。祖國醫學強調辨病與辨證相結合，其中辨證論治是祖國醫學的精髓所在，中醫證型是對疾病發展過程中的某一階段的病理概括［11］。代謝組學的研究對象是生命個體對外源性物質的刺激、環境變化或遺傳修飾所做出的所有代謝應答和動態變化過程［9］，可以為中醫辨證論治提供客觀化的依據。代謝組學最常用的分析技術是GC-TOF-MS技術，該技術始用于上個世紀70年代，此后，在疾病的診斷研究中受到廣泛運用［12］，因其具有分辨率和靈敏度高、適于痕量分析的特點，目前仍是代謝組學分析的最常用技術之一。

表2 治療組治療前后差異性代謝產物比較

表3 對照組治療前后差異性代謝產物比較

本研究使用代謝組學技術評價西醫規范治療基礎上合用血府逐瘀湯加減方后冠心病心血瘀阻證患者代謝產物變化，探討血府逐瘀湯加減方的作用機制。血府逐瘀湯源于清代王清任《醫林改錯》，是近年來中醫藥方面研究較多的活血化瘀成方。血府逐瘀湯加減方是原方去甘草，加丹參而成，方中以桃仁、紅花、川芎、赤芍、丹參、當歸活血祛瘀；牛膝祛瘀血，通血脈，引血下行；柴胡疏肝解郁，升達清陽；桔梗開宣肺氣，載藥上行，合枳殼升降氣機，開胸行氣，使氣行則血行；生地黃涼血清熱，合當歸又能養陰潤燥，使祛瘀而不傷陰血。諸藥合用，共奏活血祛瘀、行氣止痛之功。代謝組學檢測結果提示：在西醫規范治療基礎上加用血府逐瘀湯加減方，較單純西醫規范治療有顯著性差異。

治療組治療后丙酮酸、磷酸甲酯、2-羥基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸較治療前下降，這些代謝產物的異常導致了血液黏度增加，這與血瘀證稠、滯、黏、凝的特征不謀而合［13］。丙酮酸是代謝過程中重要的中間產物，三羧酸循環主要在線粒體中進行，在有足夠氧氣條件下，糖酵解生成的丙酮酸進入線粒體，經三羧酸循環被氧化成二氧化碳和水。酵解過程中產生的還原型輔酶I（NADH），則經呼吸鏈氧化產生腺嘌呤核苷三磷酸ATP和水。如果供氧不足，NADH則不會進入呼吸鏈，在某些生物中把丙酮酸還原成乳酸，在某些生物中丙酮酸會轉變為乙醇，并釋放出二氧化碳，這取決于不同的生物含有的催化酶種類不一樣。此外，丙酮酸是三大營養物質之間相互轉換的樞紐，可以通過氨基酸轉換途徑形成新的氨基酸，實現了糖類到蛋白質的相互轉化。

綜上所述，運用GC-TOF-MS技術可以檢測冠心病心血瘀阻證治療前后患者的血漿小分子代謝產物，同時可以通過該技術對代謝產物進行定量分析，以得到相關的差異性代謝產物；也能通過對血漿小分子代謝產物代謝通路分析，了解其主要代謝途徑，這些通路可作為研究中醫藥作用靶點的依據。