二陳湯對肥胖大鼠脂肪組織脂質代謝關鍵酶LPL的影響

鄢春錦 ，廖凌虹 ，陳繼承 ，丁珊珊 ，高碧珍 ，

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建省中醫健康狀態辨識重點實驗室，福建 福州350122；3.中醫證研究福建省高校重點實驗室，福建 福州350122；4.泉州市中醫院，福建 泉州 362000）

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是調節脂質代謝的關鍵酶，能分解脂蛋白中的三酰甘油［1-2］。有學者研究發現，小鼠的LPL基因的敲除將導致其內臟脂肪含量明顯上升，體質量顯著升高，脂質將沉積在靶組織［2］，因此，LPL表達的異常將影響機體的脂質代謝。二陳湯是中醫四大方證之一，主要功效是燥濕化痰、理氣和中，用于治療各種痰證，近年來的研究發現其在調節脂類代謝方面作用顯著［3-4］，但機制不明確。我們以肥胖大鼠為模型，觀察二陳湯對大鼠LPLmRNA和LPL蛋白表達的影響，以期初步闡明其可能的分子機制。

1 材 料

1.1 實驗動物 45只SPF級雄性Wistar大鼠，體質量平均為（200±20）g，3月齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：2011000521084，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級環境。

1.2 藥物與試劑 二陳湯各藥物購自福建中醫藥大學國醫堂；二甲雙胍（齊魯制藥有限公司，25 mg／片，批號：3090021KC）；Trizol Reagent（美國 Invitrogen 公 司 ）；PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Pre mix Ex TaqTM（TliRnaseH Plus）購自大連 TaKaRa公司；β-actin抗體（美國 Sigma公司）；HRP標記的羊抗兔 IgG、HRP標記的羊抗小鼠 IgG、Western blot相關試劑盒（杭州碧云天生物技術有限公司）；LPL單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.3 主要儀器 定量PCR儀（Epgradient型，德國Eppendorf公司）；化學發光熒光成像系統（Chemidocxrs+型，美國Bio-Rad公司）；蛋白轉移儀（Miniproteam 3型，美國Bio-Rad公司）；全自動生化分析儀（7180型，日本日立公司）。

2 方 法

2.1 藥物的制備 用天平稱取茯苓9 g，橘紅15 g，半夏15 g，甘草4.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水浸泡30 min，文火水煎兩次，混合兩次水煎液后用紗布過濾，再將濾液濃縮至0.435 g／mL濃度，高壓滅菌后4℃冰箱中保存備用。二甲雙胍25 mg，溶于無菌蒸餾水中，配成10 mg／mL溶液。

2.2 動物分組和給藥方法 大鼠適應性喂養1周后，按體質量隨機分為正常組10只和造模組35只。正常組由普通飼料喂養，造模組由高脂飼料喂養，高脂飼料由l%膽固醇、20%豬油、2%奶粉、4%白糖和73%普通飼料組成。喂養10周后，取造模組內體質量超過正常組大鼠體質量均值加1.4倍標準差的大鼠，其平均體質量（444.8±31.8）g與正常組（384.0±18.0）g相比差異有統計學意義（P＜0.05），判斷造模成功［5］。成功制備肥胖模型大鼠30只，其余5只大鼠體質量未達標，將其舍棄。再將30只成模大鼠按體質量隨機分為二陳湯組、二甲雙胍組和模型組各 10只。二陳湯組按 4.35 g／（kg·d）劑量灌服二陳湯，二甲雙胍組則按 100 mg／（kg·d）灌服二甲雙胍，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。藥物干預期間，正常組給予普通飼料，其他組給予高脂飼料，干預4周。

2.3 標本采集 末次灌胃后10 h（禁食不禁水），用20%烏拉坦腹腔注射麻醉（劑量為1 g／kg），腹主動脈采血制備血清，-80℃保存。取腎周脂肪組織200 mg，離體后馬上置液氮壺內，后轉至-80℃冰箱保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 血清脂質水平檢測 采用日立7180自動生化分析儀檢測大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.4.2 實時熒光定量PCR檢測脂肪組織LPLmRNA相對表達水平 各組隨機選取5份脂肪組織，采用Trizol法提取總RNA，檢測A260和A280比值，并計算RNA濃度，甲醛變性電泳對RNA完整性進行鑒定。逆轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增目的基因，目的基因和β-actin引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（LPL上游：5'-AACAT TGGAGAAGCCATTCG-3'，下游：5'-TTCATTCAGC AGGGAGTCAA-3'；β-actin 上游：5'-TGAGACCTTC AACACCCCAG-3'，下游：5'-GCCATCTCTTGCTCG AAGTC-3'）。PCR反應參數為：95℃預變性30 s，94℃變性 5 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，共 40個循環。采用相對定量法分析大鼠LPLmRNA相對表達水平，以 β-actin基因作為內參，利用 2-△△Ct法計算各組LPLmRNA的相對表達量。

2.4.3 Western印跡法檢測脂肪組織LPL蛋白表達各組隨機選取5份脂肪組織進行檢測。將樣品置于勻漿器中，加入700 μL單去污劑裂解液（含PMSF）進行勻漿，裂解細胞提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白質。配制10%分離膠、4%的濃縮膠，經SDS-PAGE電泳后電轉移至PVDF膜，置于孵育袋中加入一抗，4℃搖動孵育過夜，洗膜后加二抗，37℃搖床孵育1 h，ECL化學發光顯色，ImageJ凝膠圖象軟件分析光密度值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行處理。計量資料屬正態分布的以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間的兩兩比較采用t檢驗。

3 結 果

3.1 4組大鼠血清脂質水平比較 見表1。

表1 4組大鼠血清脂質水平比較（）mmol／L

表1 4組大鼠血清脂質水平比較（）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與二甲雙胍組比較，3） P＜0.05。

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 TC 1.40±0.11 2.00±0.091）1.82±0.133）1.50±0.232）TG 0.79±0.11 1.04±0.091）0.75±0.102）0.87±0.162）HDL-C 1.17±0.16 1.13±0.10 1.04±0.05 1.13±0.12 LDL-C 0.21±0.04 0.28±0.031）0.21±0.032）3）0.26±0.06

3.2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對表達水平比較 見表2。

表2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對表達水平比較（）

表2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對表達水平比較（）

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 LPLmRNA相對表達量0.9994±0.1761 1.0205±0.0417 1.1503±0.1780 1.0557±0.1076

3.3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達比較 見表3、圖 1。

4 討 論

超重和肥胖是多種常見慢性疾病的重要危險因素，研究肥胖的發病機制，建立有效的預防和治療措施是目前急需解決的問題。“肥人多痰”是中醫的經典理論，廖凌虹等［6］研究也發現痰是肥胖的重要中醫病理因素，從痰辨證論治，可作為治療肥胖及其誘發的多種代謝疾病的重要手段。

表3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達比較（）

表3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 LPL相對表達量1.2206±0.0317 1.5188±0.06031）1.7256±0.11242）1.7195±0.19112）

圖1 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達比較

本實驗以高脂飲食誘導，制備肥胖大鼠模型。目前國內外對肥胖動物模型的鑒定缺乏統一的標準，多數學者認為正常組與造模組的體質量有顯著性差異，即可判斷造模組出現肥胖。本實驗成模大鼠體質量超過正常組大鼠均值加1.4倍標準差，兩組間差異顯著，判斷造模成功。通過血清生化分析，我們發現模型組大鼠TC、TG和LDL-C水平比正常組明顯升高。在繼續給予高脂飲食的同時，我們用二陳湯對肥胖大鼠進行藥物干預4周，發現大鼠血清TG和LDL-C水平顯著下降。本實驗結果表明，二陳湯能在不控制飲食的情況下，降低大鼠的血脂水平，說明二陳湯可以應用于營養性肥胖伴脂代謝紊亂的治療。而經二甲雙胍干預后，則是TC和TG水平比模型組明顯降低，說明兩種藥物的作用側重點有所不同，但對于糾正脂質代謝異常都有積極的意義。

LPL是脂質代謝關鍵酶［7］，主要在脂肪組織和骨骼肌實質細胞的粗面內質網合成［8］，隨后要經過復雜的細胞內加工，其活性和濃度是影響機體血脂濃度的關鍵因素。由于肥胖人群普遍存在脂質代謝紊亂［9］，所以我們將LPL作為切入點，觀察肥胖大鼠脂肪組織LPL表達的變化。本實驗結果發現，與正常組比較，肥胖大鼠LPL蛋白表達顯著增高，提示肥胖大鼠血清TC、TG和LDL-C水平的上升，可能引發機體的調控機制，增強LPL蛋白的表達來對抗脂質代謝的異常。國外有學者的相關研究也提示，肥胖大鼠LPL蛋白呈高表達［10］。經過二陳湯治療后，肥胖大鼠LPL蛋白表達比模型組進一步增強，說明二陳湯的干預促進了LPL的高表達，催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白膽固醇中的TG水解，降低血清中TG水平，本實驗中二陳湯組大鼠血清TG水平的降低也驗證了這一點。二甲雙胍是經典的降糖藥物，是新藥研發的參照基準，不僅降糖作用顯著，也有很好的減輕體質量和糾正血脂異常的作用。我們實驗結果提示，經過二甲雙胍干預后，大鼠LPL蛋白表達明顯增強。Masahiro等［11］學者在體外培養的細胞中也發現，二甲雙胍能使LPL蛋白的表達顯著增強，我們將二甲雙胍選為陽性對照藥物，具有較好的對比作用。引起我們關注的是，本研究中肥胖大鼠LPLmRNA表達與正常大鼠無顯著性差異，而LPL蛋白表達出現了顯著性差異，這些差異說明，藥物對LPL的影響可能主要表現在翻譯和翻譯后水平上。

肥胖和其他慢性疾病一樣，致病因素和機制非常復雜，涉及許多炎癥介質、細胞因子的相互作用，關系到機體的神經體液調節。傳統方藥成分復雜，作用靶點眾多，我們的前期實驗研究證實二陳湯能促進高脂飲食誘導的代謝紊亂小鼠細胞周期依賴性蛋白激酶5調控相關蛋白1類似物1（CDKAL1）的表達，從而改善胰島細胞功能，提高胰島素水平［12］。本實驗證實二陳湯可能通過促進LPL蛋白的表達來糾正脂質代謝紊亂，是否還影響其他因子，以及是否還有其他信號通路協同作用，有待進一步研究。