大黃素對脂多糖誘導損傷胰島INS-1細胞TLR4、HO-1蛋白表達的影響

梁珊珊 ，劉銘珍 ，賴思羽 ，向 青 ，張小琴

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學康復技術工程研究中心，福建 福州 350122）

研究發現胰島B細胞分泌功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病的核心機制［1］。其中胰島素抵抗就是一種低度的炎癥狀態，而炎癥又會導致胰島B細胞功能逐漸衰竭［2-3］。已有研究表明Toll樣受體4（TLR4）可誘導參與炎癥反應的多種基因表達，血紅素氧合酶－1（HO-1）具有明顯的抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用［4-5］。

大黃素（emodin）是蓼科植物大黃的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制細胞增殖、提高免疫等多種藥理作用［6］。課題組前期研究發現：大黃素能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和空腹胰島素等，顯示出能夠增強胰島素敏感性的作用［7］。本研究旨在觀察大黃素對脂多糖（LPS）誘導的胰島INS-1 細胞模型中白介素-6（IL-6）、TLR4、HO-1 的影響，探討大黃素對LPS誘導的胰島INS-1細胞炎癥反應的調節及作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 胰島B細胞株INS-1購于中國醫學科學院細胞庫。

1.2 藥品與試劑 大黃素（大連美侖生物有限公司，批號：J0616A，純度＞97%）；RPMI 1640培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（美國Gibco公司）；LPS（美國Sigma公司）；IL－6 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液、PMSF、5X蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）；TLR4抗體（美國Santa Cruz公司）；HO-1抗體（英國 Abcam公司）；β-actin抗體（北京全式金生物技術有限公司）。

1.3 儀器 CO2培養箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）；臺式冷凍離心機（美國Thermo公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）；Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、轉印槽、ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 胰島INS-1細胞培養于含10%FBS、100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素及 50 μmol／L巰基乙醇的RPMI1640完全培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2～3 d傳代。

2.2 模型建立及藥物處理 取對數生長期的INS-1細胞以3×105細胞／孔接種于6孔板，正常培養24 h后分為空白組、模型組及大黃素組。空白組不做任何處理，模型組以20 mg／L LPS作用于INS-1細胞，大黃素組以 20 mg／L LPS+0.1 μmol／L 大黃素作用于INS-1細胞。藥物刺激12 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態差異，收集上清用于IL-6檢測，收集細胞用于Western blot檢測。

2.3 ELISA法檢測IL-6表達水平 取出-80℃保存的細胞上清，按照試劑盒說明書步驟檢測IL-6含量。以100 μL／孔加入酶標板，37℃下孵育1.5 h；取出拍干，加入稀釋后的抗體工作液100 μL／孔，37℃下孵育1 h；拍干，加入經稀釋的洗液300 μL／孔，浸泡 1 min后拍干，重復 3次；以 100 μL／孔加入已稀釋并經37℃平衡30 min的ABC工作液，37℃下作用30 min；取出重復上述洗液步驟5次，加入平衡30 min的TMB顯色液90 μL／孔，37℃反應15～20 min，最后加入TMB終止液，用酶標儀于波長450 nm處檢測A值，根據標準曲線計算出含量。

2.4 Western blot法檢測TLR4、HO-1蛋白表達將去除培養基后收集的細胞培養板，加入細胞裂解液（含PMSF），提取細胞總蛋白，采用BCA法測定細胞蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液（5×）4∶1混合，100℃變性 10 min；取 30 μg蛋白樣品上樣，SDSPAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，一抗 TLR4（1∶500）、HO-1（1∶250） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，每次 10 min；二抗（1∶3 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，每次10 min。采用ECL發光試劑顯色，并經ImageJ凝膠成像系統進行顯影檢測，分析目標條帶TLR4、HO-1及內參β-actin的灰度值，計算出目標蛋白與內參的比值，對組間差異進行統計學分析。

2.5 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料屬正態分布的以（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間的兩兩比較，方差齊時用LSD－t方法，不齊時用 Games-Howell方法；計數資料采用χ2檢驗。

3 實驗結果

3.1 大黃素對INS-1細胞形態的影響 見圖1。

圖1 大黃素對3組INS-1細胞形態的影響（×100）

3.2 大黃素對3組INS-1細胞IL-6的影響 見圖2。

圖2 大黃素對INS-1細胞IL-6的影響

3.3 大黃素對 3組INS-1細胞蛋白 TLR4、HO-1表達的影響 見圖3。

4 討 論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝疾病，其中胰島B細胞功能低下導致的糖尿病為2型糖尿病。引起血糖升高的病理機制主要是漸進性胰島B細胞的功能衰竭和胰島素抵抗。越來越多的研究表明，在2型糖尿病患者胰島也出現以巨噬細胞浸潤增加為主要特征的炎癥反應，導致胰島B細胞功能缺陷［8-10］。眾多的細胞因子和趨化因子參與了2型糖尿病胰島炎癥反應的過程。HO-1是血紅素降解的起始酶和限速酶，具有強大的抗炎及調節免疫作用。TLR4識別功能可激活NF-κB，進而導致一系列炎癥細胞因子的合成與釋放，誘發炎癥反應［11］。

圖3 大黃素對3組INS-1細胞TLR4、HO-1蛋白表達的影響

大量研究顯示：大黃素能夠抑制炎癥，提高胰島素敏感性，增加外周葡萄糖攝取。離體實驗證實：大黃素能夠通過激活PI3K／PKB信號途徑，減少NF-κB p50亞基向細胞核轉移，從而抑制LPS誘導的3T3-L1 脂肪細胞的炎癥反應［12］；通過抑制 NF-κB活性和MAPK通路，抑制經佛波醇和鈣離子通道劑A23187 刺激的肥大細胞分泌 TNF-α 和 IL-6［13］。

本實驗結果顯示：經LPS刺激的INS-1細胞，IL-6的釋放量顯著增加，TLR4蛋白水平升高，HO-1蛋白表達下降；而大黃素能顯著降低IL-6的釋放，抑制TLR4水平的升高以及HO-1水平的下降。說明大黃素能減輕LPS誘導的INS-1細胞的炎癥損傷，其機制可能與調控IL-6水平及TLR4和HO-1的蛋白表達有關。