HPLC-ICP-MS測定雙孢蘑菇珍華片原料中的6種砷形態

于 娟，陳啟蘭，陳 玨

（漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建 漳州 363000）

雙孢蘑菇珍華片是由漳州片仔癀藥業股份有限公司開發的保健食品，具有增強免疫力、保護化學性肝損傷的作用。其原料雙孢蘑菇［1-2］是目前世界上栽培最廣泛、產量最多的一種食用菌，富含蛋白質、多糖、維生素等，營養豐富，具有較高的醫療保健價值，能夠提高機體免疫功能，調節血液中葡萄糖和膽固醇的平衡，具有抗腫瘤、抗氧化、鎮痛消炎、抑菌、保肝等作用。但有研究發現：食用菌除維持自身生長發育所必需的元素外，對部分重金屬如砷等也具有富集作用。鄭偉華等［3］測定了多種食用菌中的砷，檢出率為100%。砷經食用菌富集后，通過食物鏈進入人體，對人體健康構成較大威脅。砷作為公認的有毒物質，作用于機體可引起急、慢性中毒，還具有致癌性、生殖毒性、發育毒性，其含量向來是各國法規標準的關注重點。目前國內標準以砷總量控制為主，但是僅以總砷含量評價砷攝入風險是不夠科學的。研究表明：不同的砷形態具有不同的理化性質，特別是其毒性取決于其存在的化學形態。無機砷劇毒，隨化合價的不同毒性不同，而砷的有機化合物毒性通常比無機砷小。6種主要砷形態化合物亞砷酸［三價砷As（Ⅲ）］、砷酸［五價砷As（Ⅴ）］、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷膽堿（AsC）和砷甜菜堿（AsB）對實驗小鼠的半數致死量（LD50）依次為 14、20、200～1 800、200～2 600、＞6 500、＞10 000 mg／kg［4］，由此可見，不同砷形態之間毒性差異很大，要準確評估食用菌中砷攝入風險，應 進 行 砷 形 態 分 析［5-6］。

本研究以雙孢蘑菇鮮品和雙孢蘑菇提取物為研究對象，建立高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）測定 6種不同形態砷［As（Ⅲ）、As（V）、MMA、DMA、AsC、AsB］的方法，優化并確定樣品前處理方法，進行方法學考察。雙孢蘑菇鮮品及其提取物中砷形態化合物分析方法的建立，有助于掌握雙孢蘑菇中砷形態分布規律，對于雙孢蘑菇及其制品的質量安全性評估和砷化合物人工控制具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent 7700型電感耦合等離子體質譜儀（安捷倫科技有限公司）；CR21N型高速離心機（日本日立公司）；XS204電子天平、S40酸度計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA MS3渦旋混合器（艾卡儀器設備有限公司）；Multiwave 3000微波消解系統（安東帕有限公司）；BHW-09A Digestor恒溫消解儀（上海博通化學科技有限公司）；移液槍（吉爾森科技有限公司）。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑 碳酸銨（色譜純，美國 Fluka公司）；硝酸（優級純，美國Thermo Fisher公司）；氨水（28%～30%，美國Acros Organics公司）；磷酸二氫鉀（純度＞99%，美國 Acros Organics公司）；胰酶（美國Sigma公司）；磷酸（色譜純，天津市福晨化學試劑廠）；氫氧化鈉（優級純，天津市光復科技發展有限公司）。除非另有說明，本實驗所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規定的一級水。

亞砷酸［三價砷 As（Ⅲ）］、砷酸［五價砷 As（V）］標準溶液：濃度為 1 000 μg／mL，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；砷膽堿（AsC，GBW08671）、砷甜菜堿（AsB，GBW08670）、二甲基砷（DMA，GBW 08669）和一甲基砷（MMA，GBW08668）標準溶液：均購自中國計量科學研究院；砷標準溶液：濃度為1 000 μg／mL，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。6種砷形態標準儲備液制備：用水將各種砷形態稀釋成濃度均為1 μg／mL的標液，儲存于4℃冰箱中。砷標準工作液和混合標準工作液使用時現配。

1.2.2 材料 50 mL塑料高速離心管；10 mL塑料刻度離心管；水系微孔濾膜（0.22 μm）。

2 方法與結果

2.1 樣品預處理

2.1.1 雙孢蘑菇提取物 混勻后裝入潔凈的聚乙烯自封袋中，密封保存備用。

2.1.2 雙孢蘑菇鮮品 取樣品約500 g，將其可食部分先切碎，經均質器充分攪碎均勻，制得試樣裝入潔凈的聚乙烯自封袋中，密封置于-18℃冰箱中保存備用。

2.2 人工腸液制備 取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol／L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，即得。

2.3 樣品提取 取雙孢蘑菇樣品1.0 g，精密稱定，置50 mL塑料高速離心管中，精密加入人工腸液20 mL后于37℃水浴中超聲萃取30 min；搖勻，在15 000 r／min條件下離心 10 min；精密量取5 mL上清液于10 mL的刻度離心管中，加水定至10 mL，混勻后過0.22 μm水系微孔濾膜，待測。同法制備空白溶液。

2.4 儀器條件

2.4.1 HPLC測定條件 色譜柱：Hamilton PRP X-100 陰離子分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；PRP X-100保護柱。流動相A為0.03 mol／L硝酸銨+0.03 mol／L 磷酸氫二銨（pH：9.0±0.05），流動相 B為 0.001 mol／L 碳酸銨，流速 1.0 mL／min，進樣量50 μL，按表 1進行梯度洗脫，運行時間 11 min，柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 ICP-MS測定條件 功率：1 500 W；高純氬氣為載氣；泵速 20 r／min；駐留時間：1 000 ms；采集質量數m／z＝75；采集模式：標準模式；調諧：讓儀器達到最佳狀態。

2.5 測定 待儀器狀態穩定后，測定標準系列工作液和樣品待測液。圖1為6種砷形態混合標準溶液及樣品的色譜圖。

圖1 6種砷形態混合標準溶液（A）及雙孢蘑菇樣品（B）的色譜圖

2.6 檢出限、定量限與線性關系考察 以不低于3倍信噪比（S／N≥3）確定方法檢出限（LOD），以 S／N＝10時所對應的濃度作為定量限（LOQ），結果如表 2 所示，6種砷形態的 LOD 為 0.23～0.68 μg／L，LOQ 為 0.75～2.28 μg／L。6種砷形態化合物線性關系考察結果見表2。將6種砷形態混合標液按照濃度從低至高依次進樣，結果顯示：在一定濃度范圍內，6種砷形態化合物的峰面積與濃度均呈良好線性關系，相關系數（r）＞0.999。

表2 6種砷形態的檢出限、定量限、線性方程、線性范圍及相關系數（r）

2.7 精密度實驗 按照“2.4”項下分析條件，將50 μg／L的6種砷形態混合標準溶液重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果6種砷形態峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 回收率實驗 對雙孢蘑菇鮮品及提取物進行回收率實驗，各做3個水平的加樣回收，每個水平3個平行，測定并計算回收率，結果見表3、表4。平均回收率為82.7%～107%，RSD為1.76%～7.78%。

表3 雙孢蘑菇鮮品中6種砷形態的加標回收率

表4 雙孢蘑菇提取物中6種砷形態的加標回收率

2.9 雙孢蘑菇鮮品及提取物實際樣品檢測 選購市售雙孢蘑菇鮮品及提取物，采用上述建立的HPLC-ICP-MS方法測定6種砷形態，同時采用《食品中總砷及無機砷的測定》［7］中第一篇第一法——電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定總砷含量，結果見表5。表5顯示：雙孢蘑菇鮮品及提取物中均有6種砷形態檢出，砷形態的總量與ICP-MS測得總砷含量相當，雙孢蘑菇中的砷主要以AsB的形式存在，占總量62.4%～82.9%。與雙孢蘑菇鮮品相比，提取物的砷總量降低，主要體現在AsB含量降低。

3 討 論

3.1 流動相的選擇 根據文獻資料，砷形態分析常用流動相有碳酸銨、磷酸氫二銨、乙酸鈉+硝酸鉀+磷酸二氫鈉+EDTA+無水乙醇［7-12］等，但是非揮發性緩沖鹽溶液易聚集在透鏡和采樣錐上，從而導致信號不穩定和“記憶”效應，有機溶劑在ICP中產生的碳也可造成進樣管和采樣錐、截取錐兩錐孔的變小甚至堵塞，影響信號穩定性［13］。碳酸銨因其殘留少且長時間使用也無信號漂移成為砷形態分析流動相首選，但實驗中發現，僅以碳酸銨溶液作為流動相時，AsC和AsB無法分開，結合文獻，并考慮到銨鹽對采樣錐和截取錐的損傷更小，本實驗以碳酸銨溶液和磷酸氫二銨溶液為流動相，同時加入硝酸銨以消除氯離子的干擾。經優化，最終確定0.03 mol／L 硝酸銨+0.03 mol／L 磷酸氫二銨（pH：9.0±0.05）為流動相 A，0.001 mol／L 碳酸銨為流動相B，梯度洗脫。

表5 實際樣品檢測結果mg／kg

3.2 提取方法的選擇 超聲提取利用高頻機械振動最大限度地使樣品分散在提取溶劑中，保證了提取過程中各種砷形態的有效溶出且無交叉污染。以雙孢蘑菇提取物為實驗樣品，以提取效率為考察參數，對超聲提取和熱浸提兩種方法進行比較。結果顯示：超聲提取測得6種砷形態總量高于熱浸提，與熱浸提相比，超聲提取還具有提取時間短、提取溫度低、操作簡單等優點。綜合考慮，確定采用超聲萃取作為樣品前處理方式。按照“2.3”項下樣品前處理方法，考察不同超聲時間對提取結果的影響。超聲時間為20 min時，測得各種砷形態含量明顯偏低，提取不完全；超聲時間為30、40 min時樣品中可檢出的各種砷形態含量無明顯差異，故選擇超聲時間為30 min。

3.3 提取溶劑的選擇 砷形態分析常用提取溶劑有水、水-甲醇、酸等，為減少有機溶劑的引入，排除含有甲醇的提取溶劑。另根據文獻資料［14-15］，在人工腸液中砷的溶出量大于水中，故本實驗對人工腸液和硝酸、乙酸進行比較，結果發現：以硝酸為提取溶劑，砷形態的保留時間會產生偏移，且硝酸容易氧化低價的砷，使得砷的化學形態發生變化，影響測定效果；而用乙酸提取，提取率明顯偏低，As（V）尤為明顯，測得量只有人工腸液提取所得As（V）的20%，故選擇人工腸液為提取溶劑進行超聲萃取。

3.4 標準溶液的穩定性考察 為考察標準溶液的穩定性，將配制好的50 μg／L砷形態混合標準溶液密封、避光、0～4℃保存48 h后與新配制的砷形態混合標準溶液進行比較，發現除DMA峰面積無明顯變化外，其余5種砷形態化合物峰面積均有不同程度的變化，以降低為主，其中As（V）基本上轉變成毒性更大的 As（Ⅲ），標準工作液需用時新配［4］。

本實驗建立了HPLC-ICP-MS同時測定雙孢蘑菇珍華片原料雙孢蘑菇中 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（V）等6種砷形態化合物的分析方法，確定最佳提取方法為以人工腸液水浴超聲30 min提取。該方法線性范圍寬、檢出限低、重復性好、檢測速度快，并通過加標回收實驗驗證了其適用性、準確性，適用于雙孢蘑菇中砷形態的分析檢測，有助于了解雙孢蘑菇中砷形態的分布，可為雙孢蘑菇及其精深加工產品的安全性評價提供一定的依據。