蓯蓉舒痙方對帕金森病模型大鼠紋狀體Akt／mTOR信號通路的影響

龍金瑤 ，倪錫森 ，陳劍浩 ，劉 婷，鐘佳男 ，唐嵐芳，肖紹堅 ，蔡 晶

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350108）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是老年人常見的神經系統退行性疾病之一，本病發病率有逐漸上升趨勢［1］，其主要病理變化是選擇性中腦黑質多巴胺神經元喪失，紋狀體多巴胺神經元含量顯著性減少。由于其直接致病原因是多巴胺神經元的喪失即細胞的凋亡，故延緩或減少細胞凋亡成為治療PD的一個重要手段。本實驗通過觀察蓯蓉舒痙方對魚藤酮葵花油乳液［2］制備的 PD模型大鼠Akt、P-Akt及mTOR蛋白表達的影響，進一步探討該方防治PD的作用機制。

1 材 料

1.1 動物 48只SPF級SD健康雄性成年大鼠，體質量（180±20）g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002，福建中醫藥大學實驗動物中心提供SPF級醫學實驗動物環境設施，使用許可證號：SYXK（閩）2014-0005。

1.2 主要試劑、藥物及制備 蓯蓉舒痙方由肉蓯蓉、赤芍、制黃精、牡丹皮、丹參等藥物組成，由福建中醫藥大學附屬第三人民醫院提供。藥物制備：將藥品混勻粉碎，加入蒸餾水，浸泡30 min，放入藥壺中大火煮沸后轉為小火再煮30 min，將藥汁倒出過濾藥渣；反復過濾兩次后，將藥汁倒入燒杯中，計算出高、中、低、劑量濃縮的比例，將燒杯放入水浴鍋隔水進行藥汁濃縮（終濃度為0.5 g／mL），將濃縮液置于4℃冰箱中保存。

魚藤酮葵花油乳液：取魚藤酮粉末（美國Sigma公司，批號：R8875）加入葵花油（美國Sigma公司，批號：S5007）中，稀釋成 1.5 mg／mL的魚藤酮葵花油乳液，4℃下低溫避光保存。

β-actin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：66009-1-lg，稀釋比：1∶2 000）；羊抗兔 FITC 抗體（美國 Abcam公司，批號：ab6717）；羊抗鼠 TRITC抗體（美國 Abcam 公司，批號：ab6718）；PTEN抗體（美國 Cell Signaling Techonoligy公司，批號：9188）；mTOR抗體（美國Cell Signaling Techonoligy公司，批號：2983）；SDS配膠試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯色劑、5×上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 儀器 GelDOC 2000型凝膠成像分析系統、電泳槽及轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；DU-650型蛋白分析儀（美國Beckman公司）；-4℃高速冷凍離心機（德國 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 PD模型建立及分組 將48只健康雄性大鼠隨機分為正常組8只、溶劑組8只、造模組32只。造模組大鼠于頭部皮下注射魚藤酮葵花油乳液，每天注射前先給大鼠稱重，按比例注射魚藤酮葵花油乳液每天0.1 mL／100 g，連續給藥14 d，建立PD模型；正常組不予處理；溶劑組相應部位注射葵花油乳液每天0.1 mL／100 g。造模組大鼠出現弓背豎毛，毛色發黃變臟，活動減少，爬壁次數減少的行為（記為1分）以及出現步態不穩或不能直線行走的行為（記為2分）判定為造模成功。把32只造模成功的大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各8只。

2.2 干預方法 按照人與動物體表面積折算（人臨床用量為47 g／d）計算出高、中、低劑量組的給藥量分別是 10、5、2.5 g／kg，采用蓯蓉舒痙方水煎劑定時灌胃，每天1次，灌胃前先稱重，按比例灌胃，連續灌胃2周。

2.3 取材及樣品的制備 取材之前的12 h大鼠停止進食，麻醉下斷頭、取腦，分離出中腦紋狀體（前囟后5.2 mm，正中線左右側1.0 mm，硬膜下9.0 mm），用0.9%氯化鈉溶液洗凈后置于液氮中保存。制備樣品時，將紋狀體取出后，稱量所需紋狀體，加入 RIPA 裂解液（1∶12.5 μL）充分研磨，靜置 30 min；用移液槍將組織液從研磨管中完全吸出至2 mL離心管中，每管用1 mL注射器吹打20次，放入-4℃冷凍離心機中離心 15 min（12 000 r／min）；抽取上清液加入 5×上樣緩沖液（1∶4 μL），置于沸水中 10 min，充分變性后取出含紋狀體的混合液（即樣品），放入-80℃冰箱中保存備用。

2.4 Western blot檢測 從-80℃冰箱中取出樣品，置于沸水中充分溶解5min，將樣品電泳后，以標準蛋白Mark為參照，根據蛋白分子量切取條帶，電轉至PVDF膜上；轉膜成功后搖床封閉2 h，再分別放入對應 β-actin 抗體（1∶2 000）、PTEN 抗體（1∶2 000）、mTOR抗體（1∶2 000）4℃搖床過夜；用 TBST洗 3次10 min后分別放入生物素標記的羊抗兔FITC抗體（1∶2 000）和羊抗鼠 TRITC 抗體（1∶2 000）搖床1 h；TBST洗滌后，滴加ECL顯色劑（化學發光底物和穩定劑以1∶1混合），應用DU-650型蛋白分析儀檢測條帶平均光密度值。運用Image Lab軟件計算每組的蛋白含量。

2.5 統計學方法 數據采用SPSS 24.0軟件進行分析。計量資料符合正態分布以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD－t檢驗，方差不齊則采用Games-Howell法。

3 結 果

與正常組比較，模型組大鼠紋狀體的Akt、PAkt蛋白表達減少（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組 mTOR、Akt蛋白表達增加（P＜0.05），中劑量組 PAkt蛋白表達增加（P＜0.05）。 見圖 1、表 1。

圖1 4組大鼠紋狀體中Akt、P-Akt、mTOR蛋白表達比較

表 1 4組大鼠紋狀體 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表達變化（）

表 1 4組大鼠紋狀體 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表達變化（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

mTOR 0.70±0.18 0.56±0.12 0.60±0.15 0.40±0.151）0.63±0.08 0.88±0.293）組別正常組溶劑組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 8 8 8 8 8 8 Akt 0.94±0.624）0.82±0.19 0.53±0.072）0.72±0.51 0.51±0.233）0.62±0.104）p-Akt 0.87±0.073）0.67±0.034）0.36±0.031）0.26±0.021）0.50±0.011）3）0.49±0.101）

4 討 論

PD是一種由于中腦黑質病變致多巴胺能神經元衰老死亡而出現以靜止性震顫為主要表現伴有面部表情呆滯、行走緩慢、步態異常等臨床癥狀的神經系統變性疾病［3］。祖國醫學把帕金森病歸屬于“顫證”“不寐”“肝腎陰虛”等的范疇［4］。 《奇證論卷七》曰：“顫振一證，古云木火上盛，腎陰不充，……虛則腎虧，法宜清上補下”，故應補腎益精填髓，益氣養血。陸征宇等［5］采用補腎填精方改善了PD患者的運動癥狀、認知功能障礙等。蔡晶教授經過長期臨床實踐，根據帕金森病的病機特點，創立了滋腎填精、補益肝腎、活血化瘀的蓯蓉舒痙方［6］，方中君藥肉蓯蓉具有拮抗免疫衰老［7］、減輕細胞凋亡［8］、促進神經干細胞的增殖等的作用，在臨床上配合美多巴等藥物可改善PD有關癥狀。

在Akt／mTOR通路中，Akt被上游分子激活后，活化的Akt進一步導致下游mTOR的磷酸化［9］，進而影響和調控細胞的凋亡和自噬等［10］。在Akt／mTOR通路中，Akt具有抗細胞凋亡、促進細胞存活等的作用。mTOR是Akt／mTOR的下游分子,在保護神經元方面具有重要意義。

本實驗結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠紋狀體的Akt、P-Akt顯著降低；蓯蓉舒痙方干預14 d后，與模型組比較，中劑量組大鼠紋狀體的P-Akt蛋白表達增高，高劑量組大鼠紋狀體的Akt、mTOR蛋白表達顯著增高。提示蓯蓉舒痙方可以增加大鼠紋狀體的Akt、P-Akt、mTOR的蛋白含量，促進 Akt的活化，從而激活Akt／mTOR通路，起到保護神經元的作用。

但本研究僅檢測 Akt、P-Akt、mTOR 3個蛋白，未能全面檢測Akt／mTOR通路的全部蛋白，也未能進一步做促進和抑制實驗，故未能說明中醫藥治療PD的更深層次機制，有待進一步研究。