正交設計法優化鹽膚木根總酚酸的提取工藝

何大青 ，葉永華 ，方泗楊 ，楊 玲 ，許 文 ，葉 淼 ，鄭海音 ，徐 偉

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

鹽膚木（Rhus chinensis Mills.）為漆樹科（Anacardiaceae）鹽膚木屬（Rhus）落葉小喬木，在我國除東北、內蒙古和新疆外，其余省區均有分布［1］。鹽膚木的現代研究多集中于藥食兩用的鹽膚木果［2-4］和其蟲癭（中藥名稱為五倍子）［5］，而對于鹽膚木（五倍子樹）藥材的其他用藥部位研究較少。根據福建省中藥材標準和廣東省藥材標準，鹽膚木用藥部位為其干燥根、莖，中醫理論認為其可固陽補血、壯筋祛濕，臨床用于消腫、清熱解毒、活血化瘀等［6-7］。福州海王金象中藥制藥有限公司以鹽膚木作為單方制劑開發了舒冠通糖漿，臨床上用于抗冠心病治療，療效確切［8］。

然而，查閱國內外文獻研究情況，目前對鹽膚木藥材化學成分的提取研究很少，僅有針對黃酮類成分的提取工藝研究［9-10］，而從課題組前期的鹽膚木化學成分分離鑒定結果來看，鹽膚木中高含量成分多為酚酸類成分［11］。現代藥理研究表明酚酸類成分具有良好的抗氧化、抗炎和神經保護作用［12］，可能是鹽膚木或者舒冠通糖漿的重要藥效物質基礎，并且課題組查閱文獻，以鹽膚木中總酚酸類部位進行提取工藝的研究鮮見報道。因此本研究擬采用針對鹽膚木中總酚酸的部位，以其含量作為評價指標，采用正交設計法優化鹽膚木總酚酸的提取工藝，為鹽膚木總酚酸部位的現代中藥開發利用以及合理、經濟、簡便工業化生產工藝提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津UV-1800型可見分光光度計（日本島津公司）；CPA225D型十萬分之一天平（德國Sartorius公司）；HC-2068高速離心機（安徽中佳科學儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFY-500型中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 材料 鹽膚木（批號：15122201）由安徽協和成藥業飲片有限公司提供，經福建中醫藥大學藥用植物學實驗室范世明鑒定為漆樹科鹽膚木屬鹽膚木（Rhus chinensis Mills）的干燥根，其標本（編號：YFM 20151003）存放于福建中醫藥大學生物醫藥研發中心標本室；沒食子酸（純度≥92.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸、乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品12.5 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀釋至刻度，充分搖勻；再精密量取5 mL至50 mL量瓶中，并加水定容，搖勻，即得0.05 mg／mL對照品溶液。

2.2 含量測定 參照文獻［13］測定。

2.2.1 標準曲線的建立 精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 25 mL 棕色量瓶中，依次分別加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加入11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL 水， 最后加入 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置35 min，以同樣方法處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）對濃度（X）為進行線性回歸計算，繪制標準曲線，得線性方程：

結果表明：沒食子酸在1.0～10.0 μg／mL范圍內，線性關系良好。

2.2.2 總酚酸測定 精密吸取各工藝考察的樣品溶液0.5 mL置于25 mL棕色量瓶中，依次加入1 mL磷鉬鎢酸試液、11.5 mL水，最后用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置35 min，以同樣方法處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線，計算總酚酸含量。

2.3 鹽膚木總酚酸提取工藝研究

2.3.1 單因素考察

2.3.1.1 評價指標 以總酚酸提取率為評價指標進行各提取工藝考察。

2.3.1.2 乙醇提取濃度對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g，置于圓底燒瓶，提取液料比15∶1，乙醇提取溶劑比例分別設置為40%、50%、60%、70%、80%，浸泡 30 min，回流提取 1 h，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結果見圖1。在40%～70%乙醇濃度，總酚酸提取率與乙醇提取濃度成正相關，在70%乙醇濃度時總酚酸提取率達到峰值，但在70%乙醇濃度之后，總酚酸提取率隨著乙醇提取濃度的升高而降低。初步確定乙醇提取濃度為50%～70%作為進一步正交考察的水平。

2.3.1.3 液料比對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于圓底燒瓶中，分別加入5、10、15、20、25 倍量的 70%乙醇浸泡 30 min，回流提取1 h，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結果見圖1。總酚酸的提取率隨著液料比的增大而增大，在液料比為20∶1后，總酚酸的提取率基本保持不變。因此選擇液料比為15∶1～25∶1作為進一步正交考察的水平。

2.3.1.4 提取時間對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于圓底燒瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min后，回流提取時間分別設置為 30、60、90、120、150 min，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結果見圖1。總酚酸提取率隨著提取時間的增加而逐漸上升，在提取時間為120 min之后總酚酸的提取率基本不變。因此選擇提取時間為60～120 min作為進一步正交考察的水平。

2.3.1.5 回流提取次數對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于錐形瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，提取1、2、3、4 次，按照方法“2.2”項下測定每次鹽膚木提取液中總酚酸的含量，結果見圖1。隨著提取次數的增長，總酚酸提取率逐漸降低，在提取3次之后，總酚酸的提取率已提取完全。因此確定提取次數為1～3次作為進一步正交考察的水平。

圖1 提取影響因素考察結果

2.3.2 正交設計試驗法 結合單因素實驗結果，利用DPS 14.0軟件正交設計試驗，選用L9（34）正交試驗方案，以乙醇提取濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）及提取次數（D）為考察因素，以總酚酸提取率為評價指標，結果見表1。

試驗結果表明：以總酚酸含量為評價指標，經極差分析可知，總酚酸提取率的影響因素的順序分別為：C＞B＞D＞A，對A因素，其優劣次序為A3＞A1＞A2；對 B 因素，其優劣次序為 B2＞B3＞B1；對 C因素，其優劣次序為C2＞C3＞C1；對D因素，其優劣次序為 D2＞D3＞D1，故最佳提取工藝為 A3B2C2D2，即70%乙醇濃度，液料比20∶1，提取2次，提取時間90 min。

2.3.3 提取工藝驗證 按照正交實驗結果，取鹽膚木藥材5.0 g，加入20倍量70%乙醇，浸泡30 min，回流提取90 min，提取2次。平行提取3次，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，總酚酸含量結果分別為 3.57%、3.57%和 3.59%，RSD為0.32%，平均含量為3.58%，表明優選的提取工藝穩定可行。

3 討 論

前期化學研究表明鹽膚木酚酸類成分是其主要化學成分，主要包括鞣花酸、原兒茶醛、原兒茶酸、苔黑酚葡萄糖苷、對羥基苯甲酸等［11］，具有抗菌消炎、抑制細胞凋亡［14］、抗氧化［15］、神經保護［16-17］等活性，與鹽膚木藥材的“消腫、清熱解毒、活血化瘀”作用相一致。因此鹽膚木總酚酸部位是鹽膚木的重要藥效物質。

在鹽膚木總酚酸醇提工藝研究過程中，考察了乙醇提取濃度、液料比、提取時間、提取次數等因素對總酚酸提取率的影響，并進一步采用正交設計優化最佳的提取工藝，最后確定鹽膚木總酚酸的最佳提取工藝為乙醇提取濃度70%、液料比20∶1、提取時間90 min、提取次數2次。

本研究采用正交設計考察了鹽膚木總酚酸的醇提工藝和大孔樹脂法純化工藝，為鹽膚木總酚酸的產業化生產工藝提供參考，同時也為鹽膚總酚酸部位的開發利用奠定基礎。

致謝：本項目在福建省科技廳重點實驗室、福建省中藥資源研究與開發利用重點實驗室完成。