SCNN1B與胃癌細胞上皮間質轉化相關性實驗研究*

柯東平，毛俊倩，郭甲民，馬龍安

陜西省腫瘤醫院(西安 710061)

胃癌是一種起源于胃壁黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，是發病率和病死率最高的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年約有700，000例患者死于胃癌，其治療失敗的主要原因是腫瘤的侵襲和轉移[1]。研究顯示，上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)在腫瘤的發展過程中具有重要作用[2]。該過程上皮細胞失去細胞極性和細胞間粘附，同時獲得遷移和侵襲性，成為間充質表型細胞，造成腫瘤的轉移。因此，探究影響胃癌細胞EMT的靶向分子對胃癌的治療具有重要意義。SCNN1B位于16p12.2號染色體上，編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位，與α、γ亞單位組成多蛋白復合物，控制不同器官中水和電解質的跨上皮轉運。同時，有報道顯示，包括SCNN1B編碼的β亞單位在內，ENaC亞單位均參與細胞分化[3]，并且在多種癌細胞中編碼ENaC亞單位的基因啟動子區發生高甲基化導致基因沉默[4-5]。近來研究發現，SCNN1B沉默與胃癌患者不良的疾病特異性和生存率顯著相關[6]。本研究擬采用SCNN1B過表達人胃癌細胞系SGC-7901細胞，建立胃癌裸鼠移植瘤模型，探究SCNN1B對胃癌移植瘤生長情況的影響及其與胃癌細胞上皮間質轉化的相關性，為胃癌臨床治療提供新靶點。

材料和方法

1 主要材料 E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(中國Proteintech)；Vinmentin抗體、β-actin抗體、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Wanleibio)；HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG(美國ThermoFisher)；蘇木精、山羊血清、DAB顯色液、SYBR Green(中國Solarbio)；TRIpure、Super M-MLV反轉錄酶(中國BioTeke)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：人胃癌細胞系SGC-7901細胞采用含10 %胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5 % CO2培養箱內培養。構建針對人SCNN1B過表達載體，待SGC-7901細胞生長至90 %融合時，進行轉染，G418篩選穩定轉染細胞系。

2.2 裸鼠成瘤實驗：取4周齡雌性18～22 g，BALB/c裸鼠，隨機均分為未轉染組(Control)、空載體對照轉染組(Empty vector)、SCNN1B過表達轉染組(SCNN1B)。調整各組細胞密度，制備細胞懸液，于裸鼠右前肢皮下接種1×106個SGC-7901細胞，建立裸鼠移植瘤模型。常規飼養3周后處死裸鼠，剝取腫瘤組織，觀察移植生長情況，部分用液氮凍存轉移至-70℃超低溫冰箱保存，部分用4 %多聚甲醛固定，用于后續實驗。

2.3 Real-time PCR檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標志分子mRNA的表達：采用TRIpure總RNA抽提試劑提取各組移植瘤組織樣本總RNA，并通過反轉錄PCR合成cDNA樣本。根據人相應基因序列，使用Primer premier 5.0軟件設計相應引物。取上述cDNA產物作為模板，采用Real-time PCR檢測SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA的表達。

表1 Real-time PCR引物序列

2.4 Western blot檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標志分子蛋白的表達：采用RIPA裂解液裂解各組移植瘤組織樣本，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣本，進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉溶液封閉，分別加入SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗37 ℃孵育45 min。ECL顯影，暗室曝光。采凝膠成像分析儀采集圖片，并用Gel-Pro-Analyzer軟件分析條帶的光密度值。

2.5 免疫組化檢測腫瘤組織中EMT標志分子蛋白表達：制備石蠟組織切片，常規脫蠟至水，蒸餾水和PBS清洗后，置于抗原修復液內，低火持續加熱10 min；室溫下自然冷卻，滴加3 %過氧化氫溶液，孵育15 min；滴加山羊血清封閉15 min，完成后去除血清，勿洗，分別加入E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色、蘇木精復染、脫水透明處理；中性樹膠封片，晾干后于400×顯微鏡下觀察并攝圖記錄。

3 統計學方法 采用GraphPad Prism 6.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差表示，t檢驗分析組間差異，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 SCNN1B過表達抑制胃癌移植瘤生長 采用BALB/c裸鼠皮下注射SCNN1B過表達SGC-7901細胞，培養3周。結果顯示，Control組和Empty vector組瘤體大小比較無統計學差異；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤的生長明顯受到抑制(圖1)。

2 SCNN1B過表達效果驗證 采用Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中SCNN1B的表達情況，結果顯示，與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達水平比較均無統計學差異(P>0.05)；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達水平明顯升高，差異均具有統計學意義(P<0.01，圖2)。

圖1 各組小鼠移植瘤瘤體情況

3 小鼠移植瘤組織中EMT標志物的表達情況 Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中EMT標志分子的表達情況，結果顯示，與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中上皮細胞標志物E-cadherin、間質標志物N-cadherin及Vimentin mRNA和蛋白表達水平均無統計學差異(P>0.05)；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin mRNA和蛋白表達水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖2 移植瘤組織中SCNN1B表達情況(與Empty vector組相比，**P<0.01)

圖3 移植瘤組織中EMT標志物表達情況(與Empty vector組相比，**P<0.01)

4 SCNN1B過表達抑制胃癌細胞EMT 免疫組化結果顯示，陽性染色為棕黃色顆粒。與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平均無明顯變化；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin蛋白表達水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平均明顯降低(圖4)。

圖4 SCNN1B過表達對胃癌移植瘤上皮間質轉化的影響(400×)

討 論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是第三大致人死亡的腫瘤疾病，給社會帶來巨大的壓力。由于胃癌早期臨床表現不典型，不易發現，多數患者就診時已處于中晚期，加之治療手段有限，導致胃癌的治愈率并不高。當前，隨著分子靶向治療的深入開展，探究影響胃癌上皮間質轉化的關鍵分子對于有效治療胃癌的轉移具有重要意義。

SCNN1B編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位，參與控制不同器官中水和電解質的跨上皮轉運及細胞分化過程。目前關于ENaC在癌癥中的研究顯示，在乳腺癌、神經母細胞瘤中，編碼ENaC α亞單位的SCNN1A基因啟動子區發生高甲基化引起的SCNN1A基因沉默，是上述腫瘤疾病患者預后較差的主要原因[4,7]。新近研究發現，SCNN1B可以抑制胃癌細胞的生長和轉移，且SCNN1B表達水平與胃癌患者生存率正相關[6]，上述研究提示，SCNN1B在癌癥中發揮抑癌作用，然而，其作用機制卻鮮有相關文獻進行報道，因此，為進一步闡明SCNN1B在胃癌中的作用與機制，本研究使用過表達SCNN1B的人胃癌細胞系SGC-7901細胞建立裸鼠移植瘤模型，觀察SCNN1B過表達對胃癌移植瘤生長情況的影響。上述結果顯示，SCNN1B過表達后，移植瘤的生長明顯受到抑制表明SCNN1B能夠抑制體內胃癌細胞的生長。

上皮間質轉化是指上皮細胞向間質細胞轉化的過程，與胚胎發育、傷口愈合及腫瘤侵襲轉移等過程密切相關[8]。越來越多研究顯示，EMT在胃癌細胞生長、侵襲和遷移等過程中發揮重要作用[9-10]。為明確SCNN1B對胃癌細胞的影響是否與EMT相關，本研究分別采用Real-time PCR和Western blot技術檢測過表達胃癌細胞形成的移植瘤組織中上皮細胞標志物E-cadherin、間質細胞標志物N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，在SCNN1B過表達胃癌細胞形成的移植瘤組織中，E-cadherin mRNA和蛋白表達水平均明顯上調，N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。同時，本研究進一步采用免疫組化檢測移植瘤組織中EMT標志分子蛋白的表達，結果同樣表明，SCNN1B過表達導致E-cadherin蛋白表達水平上調，N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平下調。以上結果顯示，SCNN1B過表達抑制胃癌細胞上皮間質轉化。

綜上所述，SCNN1B能夠通過抑制胃癌細胞上皮間質轉化進程對胃癌細胞移植瘤的生長起到明顯的抑制作用。因此，SCNN1B可能成為治療胃癌的潛在分子靶點。