外源Ca對旱柳Cd毒害的緩解作用

李崇豪，薛文秀，尚曉碩，鄒金華，蔣志勤

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387； 2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；3.天津師范大學化學學院，天津300387）

鎘（Cd）是自然界較為常見的重金屬元素，因其毒性大、不能被微生物降解等原因備受關注.Cd 對植物有較強的毒害作用：①抑制細胞有絲分裂，使生物量下降；②影響植物對營養元素的吸收，導致物質合成和代謝紊亂；③使植物細胞內產生活性氧，對內膜系統造成嚴重傷害[1].Ca 是植物生長發育的必需元素，參與植物體內眾多的生理生化反應[2]，對于植物抵抗逆境脅迫和提高重金屬耐性也具有重要作用[3-4].研究表明，Ca 能有效降低植物的Cd 吸收，這是因為二者具有相似的化學性質，Ca 是土壤中Cd 吸附位點的主要競爭者，從而減少Cd 對植物的毒害作用[3].Toyota 等[5]研究發現，植物體內的谷氨酸作為一種脅迫或機械損傷的信號物質，能夠將信號轉化為細胞質內Ca2+濃度的增加，從而將信號傳播到遠端器官并誘導發生防御反應.

旱柳是楊柳科（Salicaceae）中常見的樹種，因其具有根系發達、生長快、易繁殖等特點，被廣泛應用于園林綠化中[6].研究發現[7-8]，柳樹在吸收、積累以及修復土壤Cd 污染方面具有較大的潛力.如Greger 等[7]報道柳樹是Cd高積累型植物，對Cd 的富集能力優于超積累植物遏藍菜（Thlaspi arvense L），但柳樹僅適用于低、中等劑量環境Cd 污染；賈中民等[8]的研究表明，培養液的Cd 質量濃度小于10 mg/L 時，垂柳和旱柳萌條均具有較強的生長適應性，旱柳對Cd 的耐受能力大于垂柳，旱柳地上部分積累的Cd 含量和Cd 向地上部分的轉移系數均大于垂柳.本課題組以旱柳為實驗材料，采用水培法，研究外源Ca 對于Cd 脅迫下旱柳生理特征的影響，包括光合色素含量、光合日進程、保護酶活性、丙二醛含量等，為環境重金屬污染的生物修復提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

一年生旱柳（Salix matsudana Koidz）枝條，取自天津師范大學科技園.

1.1.2 試劑與儀器

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），天津市光復精細化工研究所；硝酸鈣，北京市北聯精細化學品開發有限公司.

紫外分光光度計（Lambda 35 UV/Vis Spectrometer），美國Perkin Elmer 公司； 便攜式光合儀（LI6400XT），美國LI-COR 公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 植物材料的培養和處理

把修剪好的旱柳枝條分為4 組，每組28 枝，固定在培養盆上，用蒸餾水進行培養.待長出一定的根后，更換為1/2 Hoagland 培養液，培養7 d 后更換為Hoagland全培養液.設置4 個處理：對照組；Ca 處理組，Ca2+濃度為5 mmol/L；Cd 處理組，Cd2+濃度為50 μmol/L；Ca+Cd處理組，Ca2+濃度為5 mmol/L，Cd2+濃度為50 μmol/L.室溫下培養，實驗周期為28 d，每7 d 更換一次處理液，整個實驗過程通氣.

1.2.2 光合色素含量的測定

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在添加處理液后的7、14、21、28 d，剪取各處理組葉片，沖洗干凈，吸干葉片表面水分.準確稱取0.2 g 葉片，采用丙酮法進行萃取、定容，分別測定663、646、670 nm下的吸光度，葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量的具體測定方法參照文獻[9].

1.2.3 光合日進程測定

在加入處理液后的第14 d，使用便攜式光合儀進行光合日進程測定.分別在8 ∶00、10 ∶00、12 ∶00、14 ∶00、16 ∶00 測定旱柳植株的各項光合數據.測定內容為：凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）.

1.2.4 保護酶活性的測定

以0.05 mol/L 的磷酸緩沖液為提取液，提取SOD、POD、CAT 3 種保護酶的粗酶液.具體的提取液制備和酶活性測定方法參照文獻[9-10].

1.2.5 丙二醛(MDA)含量的測定

用體積分數為10%的三氯乙酸溶液提取旱柳葉片和根中的丙二醛，采用TBA 比色法[9]測定葉片和根中MDA 的含量。

1.3 數據統計方法

采用SigmaPlot10.0 軟件和WPS 進行數據處理和作圖，采用平均值和標準誤差進行統計分析，采用SPSS13.0 對數據進行差異性分析.

2 結果與分析

2.1 不同處理對旱柳葉片光合色素含量的影響

不同處理組中，旱柳葉片的3 種光合色素含量如圖1 所示.由圖1 可以看出，4 個處理組中，葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均是對照組最高，其次是添加外源Ca 的處理組，二者的光合色素含量遠遠高于其余2 組（P ＜0.05）；再次是Ca+Cd 組，光合色素含量明顯高于Cd 脅迫處理組；Cd 脅迫處理組中的光合色素含量始終最低.由此可見，外源Ca 的添加能夠緩解Cd 脅迫造成的旱柳光合色素含量的下降.

比較4 個處理組中3 種光合色素含量隨時間的變化趨勢，總的來看，對照組和Ca 處理組的趨勢相近，Ca+Cd 處理組和Cd 處理組的趨勢相近.

2.2 不同處理對旱柳葉片光合日進程的影響

不同處理組中，旱柳的光合日進程如圖2 所示.由圖2 可以看出，4 個處理組中，對照組的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間二氧化碳濃度始終最大，尤其是蒸騰速率，遠遠高于其他3 組的數值；其次是Ca 處理組，4 項光合作用指標的數值低于對照組，均高于Ca+Cd 處理組和Cd 處理組，差異具有統計學意義（P ＜0.05）；再次是Ca+Cd 處理組，凈光合速率等顯著高于Cd 處理組，差異具有統計學意義（P ＜0.05）.這說明外源Ca 的添加確實緩解了Cd 脅迫造成的旱柳光合作用的下降.4 個處理組中旱柳的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度日進程均為典型的雙峰曲線，Cd 脅迫下，旱柳的光合日進程雖呈雙峰曲線，但變化較為平緩，添加了外源Ca 后，凈光合速率等顯著增加，變化幅度增大.

圖1 不同處理組中旱柳葉片3 種光合色素的含量Fig.1 Contents of three kinds of photosynthetic pigments in leaves of S.matsudana in different groups

圖2 不同處理組中旱柳的光合日進程Fig.2 Photosynthetic daily process of S.matsudana in different groups

2.3 不同處理對旱柳保護酶活性和MDA 的影響

4 個處理組中，旱柳葉片和根中的SOD 酶活性如圖3 所示.由圖3（a）可以看出，Cd 處理組中旱柳葉片的SOD 酶活性最大，其次是Ca+Cd 組，對照組的數值最低.由圖3（b）可以看出，對照組根中的SOD 酶活性最大，其次是Ca 處理組，Cd 處理組中的數值最低.旱柳葉片和根中的POD 活性如圖4 所示.由圖4 可以看出，旱柳葉片和根中均是Cd 處理組的POD 活性最大，其次是Ca+Cd 組，對照組的數值最低.旱柳葉片和根中的CAT 活性如圖5 所示.

圖3 不同處理組中旱柳的SOD 活性Fig.3 SOD activity of S.matsudana in different groups

圖4 不同處理組中旱柳的POD 活性Fig.4 POD activity of S.matsudana in different groups

圖5 不同處理組中旱柳的CAT 活性Fig.5 CAT activity of S.matsudana in different groups

由圖5 可以看出，旱柳葉片和根中的CAT 活性均是在對照組中的數值最大，其次是Ca 處理組，Cd 處理組中的活性最低.

旱柳葉片和根中的MDA 含量如圖6 所示.由圖6可以看出，葉片和根中均是Cd 處理組的MDA 含量最大，其次是Ca+Cd 處理組，對照組的MDA 含量最低.由此可見，Cd 脅迫確實能夠對旱柳造成過氧化損傷，外源Ca 則能夠緩解這種損傷.

圖6 不同處理組中旱柳的MDA 含量Fig.6 MDA contents of S.matsudana in different groups

3 討論與結論

Cd 是植物生長發育中的非必需微量元素，它對植物的生長發育有顯著抑制作用[11].本研究用50 μmol/L的CdCl2處理旱柳枝條，發現Cd 處理顯著降低了旱柳葉片的葉綠素含量和光合作用效率，對葉片和根的保護酶系統以及MDA 含量都有不同程度的影響，而外源Ca 的添加則會緩解旱柳因Cd 脅迫而遭受的損傷.

光合作用是植物生長發育的基礎生命活動，葉綠素含量是決定光合作用的基礎，同時也是可以代表光合作用強度的指標[12].Cd 脅迫下旱柳葉片葉綠素含量減少的原因可能是：①Cd 進入植物體內占據了葉綠素合成酶相應的離子結合位點，造成酶的失活[13]；②Cd脅迫下，植物產生過量的過氧化物和超氧化物加速了葉綠素的分解，從而導致葉綠素含量的降低； ③Cd脅迫影響植物細胞正常的分裂分化，內膜系統遭到破壞，從而降低了葉綠素含量[14].添加外源Ca 后，旱柳葉綠素含量有顯著提高，即外源Ca 可以在一定程度上緩解Cd 對旱柳葉綠素的損傷[15].但過多的Ca進入植物細胞則會造成光合色素含量的降低[16]，本研究發現單獨添加Ca 時旱柳的葉綠素含量也會減少.

Cd 脅迫降低了旱柳的凈光合速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導度和蒸騰速率.一方面，可能是因為Cd影響了光合作用中PSⅡ催化中心的金屬結合位點[17]；另一方面，Cd 進入植物細胞后會抑制植物對Mg2+的吸收，而后者是構成葉綠素的必需元素且在光合作用中有著重要的催化作用[18].相關研究表明，外源Ca 的添加能夠促進Mg2+在光合作用中的電子傳遞，從而提高植物的光合作用[19].本研究也證實了外源Ca 的添加能夠顯著緩解Cd 脅迫對旱柳光合作用的負面影響.

當植物受到Cd 脅迫時會產生大量的過氧化物[19]，引起細胞內膜系統的損傷，從而抑制植物的生長發育.植物體內的SOD、POD、CAT 酶是保護細胞免受過氧化物傷害的保護酶，在植物受到過氧化物傷害時大量合成[20].SOD 酶可以將超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2；POD 酶可以通過愈創木酚作為電子供體在底物氧化過程中清除H2O2；CAT 酶可以將H2O2轉化為H2O和O2.添加外源Ca 后，葉片和根中的保護酶活性均發生了顯著變化，證明Ca 作為第二信使可以通過鈣調蛋白影響蛋白激酶的活性，在一定程度上緩解了Cd 對旱柳的傷害作用[21].

MDA 是植物體受到外界脅迫時膜質過氧化的產物，其含量可以反映植物受到傷害的程度[22].本研究中Cd 處理組葉片和根的MDA 含量均顯著高于其他處理組，證明Cd 脅迫導致旱柳體內發生了大量的膜質過氧化作用.在添加Ca 后，旱柳根和葉片中的MDA含量均明顯降低，證明Ca 對Cd 脅迫造成的旱柳膜質過氧化具有緩解作用[23].

綜上所述，外源Ca 能夠通過提高植物的葉綠素含量和光合作用效率、影響保護酶系統、降低MDA 含量等，緩解Cd 污染環境中旱柳遭受的毒害.因此，在利用旱柳修復環境重金屬污染中，可以適度添加Ca，以此緩解Cd 對旱柳生長的破壞作用，提高旱柳的成活率.