荷葉茶制作工藝與正交試驗法優選荷葉茶浸提工藝分析*

陳秋香， 劉 靜

1.長沙市中醫院(長沙市第八醫院)(長沙 410100)；2.中國中醫科學院中藥研究所(北京100700)

荷葉是睡蓮科多年生水生植物蓮(Nelumbo nucifera gaertn.)的新鮮或干燥成熟葉片，常在夏、秋兩季采收[1]。蓮作為兼具藥食觀賞價值的經濟植物，在我國廣泛種植。據統計,蓮在我國的種植面積達500萬畝以上，每年荷葉的采收量可達800萬噸，資源非常豐富。在中華人民共和國衛生部的衛監發(1991)第45號文件中，荷葉被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單。傳統醫學認為,荷葉具有清暑化濕、生發清陽的功效，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛泄瀉，血熱吐衄，便血崩漏等癥[1]，記入藥典的中藥。近年來，關于荷葉的研究不斷深入。荷葉的活性成分主要是荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、N-去氫荷葉堿、O-去氫荷葉堿等生物堿以及蘆丁、金絲桃苷等黃酮類化合物，現代藥理研究表明其具有抑菌[2]、抗氧化[3]、調節血脂[4]等作用。刑毅[5]研究發現荷葉提取物能夠降低小鼠血清 TC、TG、LDL-C 的水平，且高劑量下對其水平的改善與血脂膠囊相當，表明荷葉提取物具有降低血脂的功效。荷葉中的生物堿可通過活化AMPK信息通路，改善成熟脂肪細胞的糖脂代謝，從而產生調脂減肥的生理作用[6]。目前對荷葉的初步開發主要有茶劑、煎劑和膠囊等。隨著時代的不斷發展，健康逐漸成為關注的重點，具有減肥降脂功能的荷葉茶的研究逐漸成為熱點，荷葉功能茶飲料[7]、荷葉降脂茶飲料、菊粉荷葉茶飲料等應運而生。由于荷葉潛在的臨床和市場價值，成熟荷葉葉片在現代醫學中被用于肥胖、高血脂癥和高血壓等的治療，已成為開發天然、安全、特效減肥藥品最具潛力的首選藥材之一[8-9]。

本實驗擬用一定的方法處理新鮮荷葉，獲得荷葉茶產品，并通過高效液相色譜法分析荷葉中主要的活性成分——黃酮類和生物堿類成分，考察制茶工藝的穩定性。同時，采用正交試驗設計，以荷葉堿與總黃酮成分為指標，確定荷葉茶的最佳浸提工藝，為荷葉茶作為綠色、健康的茶飲研究夯實基礎。

材料和方法

1 主要儀器與試藥 RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮)；色譜柱Sunfire C18柱、Xbridge Amide C18柱(沃特世，美國)；AEQ-120電子天平：島津；1290-HPLC：安捷倫(安捷倫，美國)；標準品荷葉堿、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷均來自安普公司；濾器0.22um安普公司電熱恒溫鼓風干燥箱(長沙醫療機械廠)；鮮荷葉：采用福建子蓮產區新鮮荷葉。

2 研究方法

2.1 荷葉茶制作工藝：新鮮荷葉先切碎后用130℃微波殺青，碾磨后在150℃ 干燥5 min左右，逐步降溫到130℃干燥5 min，100℃干燥5 min，即得荷葉茶。

2.2 黃酮和生物堿含量測定的色譜條件

2.2.1 黃酮化合物含量測定色譜條件：利用 Sunfire C18(150 nm×4.6 nm，3.5μm)色譜柱，在350 nm波長下，參照Chen et a[10]報道的色譜條件，流動相A為0.5%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫(0～10 min，12% B；10～32 min，12%～20% B；32～40 min，20%～30% B；40～48 min，30%～60% B；48～49 min，60%～12% B；49～53 min，12%)，流速0.6 ml/min，檢測波長350 nm，柱溫30℃，進樣的體積為10 μl。

2.2.2 生物堿化合物含量測定色譜條件：利用Xbridge Amide C18(250 nm×4.6 nm，5 μm)色譜柱，在272 nm波長下，參照 Chen AD.[11]報道的色譜條件，流動相A為0.1%三乙胺，B為乙腈，梯度洗脫(0～15 min，40%～80% B；15～18 min，80% B；18～19 min，80%～40% B；19～22 min，40% B)，流速0.8 ml/min，柱溫30℃，進樣量10 μl。

2.3 標準品標準曲線的建立：精密稱定金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷以及荷葉堿標準品，分別用純化水稀釋成六種適當的不同濃度，參照2.2 黃酮和生物堿含量測定的色譜條件分別進行含量測定。每個濃度測量3次，以標準品濃度值為縱坐標，平均峰面積為橫坐標，建立標準曲線。

2.4 高效液相色譜法檢測荷葉茶中黃酮和生物堿的含量：參照2.2 黃酮和生物堿含量測定的色譜條件對荷葉茶進行含量測定。

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設計：荷葉茶采用100℃沸水進行浸提，設置茶水比(A)、浸提次數(B)、浸提時間(C)3個因素，茶水比分別為30∶1，50∶1和80∶1，分別浸提1次，2次和3次，每次時間分別為10 min、30 min和60 min各三個水平。采用 L9(34)正交表設計優選最佳浸提工藝。因素水平表見表1。

表1 浸提因素和水平考察

2.5.2 正交試驗與含量測定：精密稱定荷葉茶1 g，按L9(34)正交試驗表進行浸取實驗。浸取完畢后，過濾，合并濾液，于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至一定程度后，將濃縮液置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干。取純化水2 ml溶解殘渣，作為供試品溶液。平行3次，按標準品測定方法進行含量測定。

2.5.3 驗證試驗：精密稱定荷葉茶1 g，按正交試驗結果確定的工藝條件茶水比為50∶1，浸提2次，每次30 min，進行驗證性試驗。共檢測3批次樣品，測荷葉堿與總黃酮含量。

結 果

1 高效液相色譜法檢測荷葉茶中黃酮和生物堿含量 用液相色譜法檢測到荷葉茶中含有的黃酮和生物堿含量結果見圖1和表2。圖1為黃酮類化合物在液相上350 nm下的紫外吸收圖和生物堿類化合物在液相上272 nm下的紫外吸收圖，圖中化合物的含量與表2是一致的。這一結果表明，鮮荷葉中活性黃酮類和生物堿類的成分都得到了很好的保留，荷葉茶制作工藝可行。

圖1 荷葉茶中黃酮類化合物和生物堿類化合物的紫外吸收圖

2 正交試驗與含量測定結果 按正交試驗設計，以3次平行實驗的平均值為正交試驗的結果值，表3。

3 試驗結果的直觀分析 對試驗的結果進行直觀分析，得到表4。由表4可知，總黃酮含量項下RA>RB>RC，即影響總黃酮含量的因素程度為A>B>C，說明茶水比是影響浸提總黃酮的最主要因素，浸提時間影響較小。生物堿含量項下RC>RB>RA，即影響生物堿含量的因素程度為C>B>A，表明浸提時間是影響浸提生物堿的最主要因素，茶水比影響較小。總黃酮含量與生物堿含量項下，各因素的K2值均大于K1和K3，反映各因素在水平2條件下，對浸提結果作用最大。故荷葉茶的最佳浸提工藝應為A2B2C2，既茶水比為50∶1，浸提2次，每次30 min。Ki=∑χi/3，Rχ=Kmax- Kminχ為因素i的水平。

表2 荷葉茶中黃酮類和生物堿類化合物的含量

表3 正交試驗結果

4 驗證試驗結果 取3個批次荷葉茶，按最佳浸提工藝測得荷葉堿含量依次為467.44 μg/g、477.81 μg/g、472.64 μg/g，總黃酮含量依次為7088.12 μg/g、6967.45 μg/g、7007.39 μg/g。3個批次總黃酮含量均值為7020.99 μg/g，RSD值為0.88%；生物堿含量均值為472.63 μg/g，RSD值為1.10%，總黃酮與生物堿的含量與正交初步篩選出來的浸提工藝A2B2C2的試驗結果僅有微小差別，表明優選出的浸提工藝穩定且提取效果佳，適合荷葉茶的浸提。

表4 正交試驗直觀分析

討 論

荷葉具有降血脂作用，將荷葉與黑茶組方后，不僅可以明顯改善內生濕熱證患者的濕熱內蘊癥候表現、高血壓狀態、降低甘油三酯、提高HDL-C、改善胰島素抵抗的功效，同時還可以降低炎癥因子TNF-a、IL-1和腫瘤相關指標，并可能對預防飲食相關的腫瘤有一定的作用[12]近年發現荷葉還具有抑制脂肪肝，抗動脈硬化、保護心血管，抗病毒、保肝、抗纖維化等藥理活性[8]。有的藥理作用還沒有被充分利用，大多用于復方制劑中，其原因是：操作程序沒有規范化、標準化，使質量不能得到有效的控制[13]。微波殺青工藝制作的荷葉茶，能夠很好地保留荷葉中的各種活性黃酮和生物堿類成分。

荷葉是一種常見的藥食同源中藥，在我國分布廣泛,資源豐富，價格低廉，但大部分都自然凋零廢棄在田地中，沒有有效的利用起來，造成了資源的極大浪費。不僅如此，廢棄的荷葉可能會污染河道，降低水質，致使荷塘沼澤化，不利于生態的健康可持續發展。將荷葉制作成保健茶的方式，使用和貯藏方便、簡單，用藥依從性好，能促進中藥資源更好地開發利用。100°C沸水常用于泡茶，所以,本試驗利用其作為荷葉茶的浸提溶劑，更具實用性。

生物堿和黃酮類化合物是荷葉的主要活性成分，荷葉堿為荷葉中最主要的生物堿[14-15]，其亦是中藥荷葉質量的重要考察指標[16-17]。金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷是荷葉黃酮類化合物的主要成分[1]，故以其總含量作為總黃酮含量考察具有代表性。下一步實驗將涉及對荷葉有效成分的毒副反應及藥效評價的研究。

目前荷葉茶品種單一，檔次低下，荷葉資源有待充分挖掘和利用。通過優化荷葉的提取工藝，革新荷葉茶的制作工藝，豐富荷葉茶的品種，增強荷葉茶的感官品質和穩定性，為荷葉茶制作標準的制定和有效利用荷葉資源提供實驗基礎，對荷葉茶的深加工與后續研究甚至周邊產業的發展，具有重要的價值。