益氣化瘀口服液質量標準研究*

徐 智，張友志，郭昌洪，易生福

1.湖北省荊州市中醫醫院藥劑科(荊州 434010)；2.湖北省荊州市中醫醫院制劑中心(荊州 434010)； 3.湖北中醫藥高等?？茖W校實驗中心(荊州 434020)

益氣化瘀口服液系由黃芪、赤芍、當歸、丹參、山楂、牛膝、葛根、紅花等十六味中藥組成的復方制劑，是我院已故著名老中醫劉云鵬主任醫師(1910-2013)自用養生秘方，其80歲時貢獻于醫院，經現代制藥技術加工制作而成，具有益氣活血化瘀之功效。治療高脂血癥45例，總有效率91.1%；治療高黏稠血癥108例，總有效率100%；明顯降低血清中同型半胱氨酸(HCY)水平，從而降低缺血性腦卒中發生風險[1-3]。取得醫療機構制劑注冊批準文號(鄂藥制字Z20180696)，院內臨床使用多年，患者反響良好。益氣化瘀口服液現行質量標準是對當歸和丹參進行薄層鑒別，為了更好制定本制劑的質量控制標準，提高藥品安全性、穩定性，讓患者放心服用本藥品，本研究在原薄層鑒別的基礎上增加了黃芪的薄層鑒別，并采用高效液相色譜--蒸發光散射檢測器(HPLC--ELSD) 法對方中君藥的主要化學成分-黃芪甲苷進行含量測定。以期為益氣化瘀口服液的質量控制標準提供依據。

材料和方法

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Waters1525高效液相色譜儀；Alltech ELSD-2000 蒸發光散射檢測器；METKER AE240電子分析天平；N2000色譜工作站；SP-30E型全自動薄層色譜點樣儀；GoodLook-1000型-全自動薄層色譜成像系統；ICH 110型恒溫箱；KH5200V型超聲波清洗器；D24UV型超純水器。

1.2 試藥：黃芪甲苷標準品(批號：0781-201711)、黃芪對照藥材(批號：140991-201707)、當歸對照藥材(批號：151311-201801)、丹參對照藥材(批號：131312-201704)，均來自中國食品藥品檢定研究院(NIFDC)，甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑都為分析純。益氣化瘀口服液由荊州市中醫醫院制劑中心提供，(批號：20180425、20180814、20181019，規格10ml/支)。

2 薄層鑒別

2.1 當歸：取益氣化瘀口服液30 ml，正丁醇提取3次，每次50 ml，加入正丁醇后用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次30 ml，用正丁醇洗至中性。向正丁醇蒸干后的殘渣中加入甲醇1 ml溶解，作為供試品。取除當歸外的其他成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性對照組溶液。將1 g當歸對照藥材加入30 ml甲醇，加熱回流1 h，冷卻后過濾、蒸干，殘渣中加水30 ml使之溶解。同法制備對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典(2015年版)》的薄層色譜法，吸取上述溶液各5 μl，點于硅膠G薄層板(10×20 cm)上，用氯仿-甲醇-水混合液(13∶6∶2)的下層溶液作為展開劑[4-5]，取出、晾干。噴10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰為止。見圖1。

1：當歸陰性對照品；2：當歸對照品；3：當歸供試樣品；4：當歸對照藥材

圖1當歸TLC圖譜

2.2 丹參：取益氣化瘀口服液15 ml，用三氯甲烷提取2次，每次15 ml，合并提取液，蒸干后加1 ml甲醇于殘渣中，作為供試品溶液。取除丹參以外的其他成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性對照組溶液。取將1 g丹參對照藥材加入30 ml水，加熱回流1 h，冷卻后過濾、蒸干，殘渣中加2 ml乙醇使之溶解。同法制備對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典(2015年版)》的薄層色譜法，吸取上述溶液各5μL，點于硅膠G薄層板(10×20cm)上，用環乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙肝混合液(3∶3.5∶1.5∶0.5∶1)的下層溶液作為展開劑[4-6]，置于展開缸，預飽和30 min，展開，取出并晾干，365 mm紫外燈下檢視。見圖2。

1：丹參陰性對照品；2：丹參對照品；3：丹參供試樣品；4：丹參對照藥材

圖2丹參TLC圖譜

2.3 黃芪：取益氣化瘀口服液30 ml，加入稀鹽酸調整pH值至2。采用醋酸乙酯震蕩提取3次，每次50 ml，隨后水浴蒸干，向殘渣中加入甲醇1 ml使之溶解，作為供品溶液。取除黃芪以外的其它成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性對照組溶液。將1 g黃芪對照藥材加入乙酸乙酯-甲醇混合液(3∶1)60 ml中[4,7]，加熱回流30 min，過濾，蒸干，向殘渣中加入甲醇5 ml使之溶解，將上清液作為對照藥材溶液。取黃芪苷為對照品，參照《中華人民共和國藥典(2015年版)》[8]的薄層色譜法，吸取上述溶液各1 μL，點于硅膠G薄層板(10×20 cm)上，用醋酸丁酯-甲酸-水混合液(7∶4∶3)的上清液為展開劑，展開后取出，晾干。噴2%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰為止。見圖3。

1：黃芪陰性對照品；2：黃芪對照品；3：黃芪供試樣品；4：黃芪對照藥材

圖3黃芪TLC圖譜

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統適應性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；Thermo色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)以乙晴-水(30∶70)溶液為流動相，流速為1 ml/min[9-10]。柱溫設置為30℃，檢測時波長設置為276 nm。蒸發光檢測器溫度設置為70℃，氣流2 L/min、增益2。理論塔板數按照黃芪甲苷峰計算≥4000。色譜圖如圖4。

圖4 黃芪甲苷的HPLC色譜圖

3.2 對照品溶液的制備：取黃芪甲苷標準品6.25 mg，將其置于25 ml容量瓶中，加入甲醇定容，濃度為250 μg/ml，將其作為母液。取母液1.25 ml、2.5 ml、3.75 ml、5 ml、6.25 ml、7.5 ml分別置于25 ml容量瓶，用甲醇溶解作為對照品。

3.3 供試品溶液的制備：取益氣化瘀口服液，搖勻，過濾，精密量取20 ml，置100 ml 分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，20 ml/次 , 棄去三氯甲烷[8], 水層再用水飽和的正丁醇萃取4次(30、30、20、20 ml), 最后1次水放凈,合并4次正丁醇萃取液, 用氨試液洗滌2次(每次5 ml );棄去氨試液,繼續用正丁醇飽和水溶液洗至中性,棄去水液。取正丁醇溶液蒸干,殘渣加水10 ml ,使其溶解通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.0 cm ,長15 cm),依次用水50 ml、40 %乙醇50 ml、70 %乙醇50 ml洗脫 ,收集70 %乙醇洗脫液,蒸干,精密加入甲醇(色譜純)10 ml使其溶解, 定容,作為供試品溶液[11-13]。

3.4 陰性對照品溶液的制備：按照益氣化瘀口服液原方組成及制備方法，按“3.3”項下方法制備不含黃芪的陰性樣品溶液。

結 果

1 線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷(C=0.25 mg/ml)對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，注入色譜儀中，測定峰面積?；貧w方程：Y=1.74X-156.61，r=0.9996(n=6)表明黃芪甲苷在0.120～0.745 μg范圍具有良好的線性關系。

2 穩定性試驗 精密吸取由益氣化瘀口服液制成的供試品溶液10 μl，分別于1、2、4、8、12、24 h測定黃芪甲苷含量，結果RSD%為0.52%，說明24 h內其穩定性良好。

3 精密度試驗 標準品(0.25 mg/m)10μl，重復進樣6次，測定其峰面積，計算RSD%為1.48%。

4 重復性試驗 取同一批號樣品(批號：20180814)分成6份樣品溶液，按“3.1”色譜條件測定其峰面積。結果RSD%為2.66%。

5 回收率試驗 精密量取樣品6份，每份(0.25 mg/ml)1 ml，置于25 ml容量瓶，加入益氣化瘀口服液4 ml，按照益氣化瘀口服液供試品制備，上樣10μL，按“3.1”項下方法測定，計算回收率，平均值為96%，RSD%為1.45%(n=6)。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

6 含量測定 取不同批次益氣化瘀口服液按上述方法測定黃芪甲苷的含量，3批樣品測量，見表2。

表2 三批黃芪甲苷含量檢測結果

討 論

益氣化瘀口服液方中重用味甘性溫的黃芪，入脾肺二經，可大補元氣，益衛升陽，祛瘀而不傷正，是為君藥，現代藥理研究表明其具有抗衰老、增強代謝、降壓、保護心功能、免疫調節等作用。醫院以前的審定鑒別標準中，只對方中當歸、丹參進行薄層鑒別，本研究在此基礎上增加了黃芪的薄層色譜鑒別，多項薄層鑒別保證定性鑒別結果更準確，在薄層的基礎上，本研究緊跟現代制藥技術，參考相關文獻對方中16味中藥的理化性質進行理論分析，確定了對方中黃芪的主要化學成分黃芪甲苷進行了含量測定。依據《中國藥典》2015版要求，對中藥制劑需進行定量分析，從院內自制制劑長遠發展的角度，須提升院內制劑的質量標準。黃芪為益氣化瘀口服液方中的君藥，經現代藥理研究證明，其主要核心成分是黃芪甲苷。目前對黃芪甲苷含量測定的方法有薄層色譜掃描法、UV-HPLC法和ELSD-HPLC法。但黃芪甲苷僅在200nm紫外區有末端吸收，故用UV-HPLC 法干擾很大。而蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，適用于無紫外末端吸收皂苷類化合物，它具有分辨率高, 重復性好 , 簡便快速的優點。