利用InDel標記分析23份黃瓜種質的遺傳多樣性及核心種質資源篩選

張紅梅，翟 文，金海軍**，丁小濤，余紀柱

（1上海市農業科學院設施園藝研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海201403；2東華理工大學化學生物與材料科學學院，南昌330013）

黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，也是遺傳研究的一個模式植物［1］。近年來，由于栽培品種遺傳背景逐漸狹窄，品種間的遺傳多態性遠遠低于同屬的甜瓜［2］。利用多態性豐富的種質資源，拓展黃瓜作物的遺傳多樣性對黃瓜遺傳育種及生產有著十分重要的意義。傳統的育種方法很難滿足黃瓜遺傳改良發展的需求，目前分子標記是進行黃瓜種質遺傳多樣性及親緣關系分析的有效工具［3］。RAPD、AFLP、SSR［4-6］等現代分子標記技術已經在黃瓜遺傳育種中得到了應用。核心種質庫能夠以最小的種質資源數目，最大程度地代表資源總體的遺傳變異，可大幅減少資源研究的人力和物力，是研究物種遺傳多樣性和人工馴化的理想材料［7-8］。構建核心種質庫的方法有聚類法、抽樣法、最大化法（Maximum strategy，M策略）等［5］。M策略能夠最大限度地保留等位基因數目，即選擇具有高豐度等位基因且低遺傳冗余的材料［9-10］。采用M策略預測核心種質的最佳抽樣比例，目前已在水稻［11］、蘋果［9］、咖啡［10］等作物中廣泛應用。

基于全基因組重測序開發的InDel（Insertion-deletion）插入缺失標記與其他標記反映的基因組信息不同，具有分布廣、多態性強、密度高、變異穩定等優點［12］，在黃瓜種質資源遺傳多樣性的評價［13］、品種純度［14］、親緣關系鑒定［13］、核心種質資源構建［15］、遺傳圖譜的構建、苦味［16］和白粉病［17］等重要性狀定位以及分子育種上都有重要的應用價值。本研究擬應用分布于黃瓜7條染色體上的InDel標記，在23份有代表性的黃瓜種質中分析其遺傳多樣性，結合表型特點構建核心種質庫，以期為黃瓜種質資源的鑒定和利用提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 供試材料

挑選23份不同地理來源的黃瓜自交系種質為研究材料，其中有13個來自亞洲（日本、韓國和中國），8個來自歐洲、2個（加工型黃瓜）來自美國，其性狀特點如表1所示。所有材料均由上海市農業科學院設施園藝研究所收集。

表1 23個黃瓜種質的性狀特點Table1 Morphological characteristics of 23 cucumber germplasms

1.2 試驗方法

1.2.1 23個黃瓜種質的表型性狀鑒定

2016年2月26日，將23個黃瓜種質各分別播種30個單株，在苗期調查白粉病和霜霉病的病情指數，在結果期調查商品瓜的瓜形、瓜長、瓜直徑、瓜色、瓜刺顏色，測量結果取平均值。白粉病和霜霉病發病率的調查方法是分別用含量為1×105個/mL和5 000—7 000個/mL的懸浮孢子液，在濕度80%、白天26℃/夜晚18℃環境下分別接種黃瓜幼苗葉片，將發病級別分為0—5級，計算病情指數［18-19］。

1.2.2 InDel標記分析

在黃瓜生長的幼苗期取葉片，混合取樣。試驗材料基因組DNA提取采用CTAB法［20］。PCR反應體系為20μL，其中DNA模板50 ng，10×Buffer 2μL，Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物0.4μmol/L，Taq酶1.2 U，ddH2O補足至20μL。PCR反應程序為：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，33個循環；72℃7min；4℃保存。使用8%（W/V）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓150 V，電泳時間45 min。銀染顯色后照相保存。

1.2.3 數據分析

應用NTSYS-pc2.1軟件中的SAHN程序計算相似性系數，用UPGMA方法繪制聚類圖，主成分分析應用軟件中的Decenter和Eigen模塊并繪圖，應用Structure 2.3.4軟件［21］進行群體遺傳結構分析，混合模型群體數目（K值）設置為2—8，對每個K值對應的Var［ln P（D）］值的標準差進行計算，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）設置10萬次迭代，初始burn-in次數為10萬，基于數學模型確定群體分組，并計算個體相應的Q值。應用Mstrat軟件［22］，用M（M method）和R（Random）兩種方法預測核心種質最佳樣本，設置參數為20次重復（Replicates），每次重復20次迭代次數（Maximum iterations），每次遞增1個樣本（Step）數。

2 結果與分析

2.1 InDel分子標記

挑選均勻分布于基因組的93對InDel引物［22］，對23份有代表性的黃瓜種質進行擴增，篩選到66對InDel引物（表2）有多態性且有較清晰的目標產物，多態性比率為71%。經統計，這66對引物共獲得121個多態性位點，說明這批InDel標記基因組的覆蓋度高，而且多態性強，能夠較好地應用于黃瓜遺傳多樣性分析。

表2 InDel標記在黃瓜基因組中的分布Table 2 Distribution of InDelmarkers in cucumber genome

2.2 23份黃瓜種質的遺傳多樣性分析

對23份黃瓜種質的遺傳相似性系數進行統計發現，相似性系數在0.23—0.95，平均值為0.56，主要分布在0.3—0.4區間和0.7—0.8區間內，分別占總數的24.1%和24.9%。遺傳相似性系數低于0.6的有137對組合，占全部組合的比率是54%，說明這些材料的遺傳多樣性較好。

將23份黃瓜種質進行聚類分析表明（圖1），在遺傳相似性系數0.61處，23份材料分為三大類群，P1有12個種質，主要來源于亞洲，包括北京、上海、遼寧、日本和韓國；P2有10個種質，大多來自歐洲，還包含美國加工型黃瓜；來源于廣東的14號種質被單獨地分到P3，是來自南方的種質，商品瓜表現為短棒形、白刺、抗白粉病和霜霉病。

應用主成分分析方法（PCA）對23個黃瓜種質的親緣關系進行分析，第一、第二主成分貢獻率分別為41%和35%，累計貢獻率為75%，能反應23個變量的主要信息。繪制PCA的2D聚類圖可以看出，P1與P2、P3被明顯地分開，說明它們的親緣關系較遠。P1中來源于亞洲的材料遺傳多樣性較豐富，如7號、8號來自上海的種質與這個亞群中其他種質遺傳差異較大（圖2）。P3的親緣關系在P1和P2之間，更接近P1（圖2）。

圖1 23份黃瓜種質的UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA cluster analysis of 23 cucumber germp lasm s

圖2 23份黃瓜種質的PCA分析Fig.2 PCA analysis of 23 cucumber germ p lasm s

遺傳結構分析結果顯示：K值為3時得到最佳分組。如圖3所示，該結果與聚類和主成分分析得到的結果一致，P3遺傳結構中有42.9%的遺傳成分與P1相似，P2（歐美種質）和P1（亞洲種質）這兩個亞群之間遺傳差異明顯，基因交流較少。總的來說，3個遺傳多樣性分類分析方法的結果大致相同。

圖3 23份黃瓜種質遺傳結構分析的3個亞群Fig.3 Three subgroups of genetic structure analysis of 23 cucumber germplasms

2.3 基于M 策略構建黃瓜核心種質資源庫

利用InDel標記分析的結果，對核心種質最佳樣本量進行預測，并構建黃瓜的核心種質庫。將23份黃瓜種質的基因數據輸入Mstrat軟件，先模擬核心種質庫不同取樣大小時等位基因的覆蓋度。如圖4所示，M方法和R方法分析得到結果基本一致，當取樣群體為1—5時，所包含的等位基因數呈指數級增長，到5時即可涵蓋約230個基因，為黃瓜遺傳變異的87%；此后增幅減緩，并在取樣量為9時接近閾值，因此將核心種質庫的群體大小確定為9。建庫過程重復20次，將各種質資源按在上述模擬結果中出現的次數排序，選取出現次數較多的9份種質構成黃瓜核心種質庫，包含材料編號為2、14、3、6、7、17、22、9、13。

圖4 黃瓜核心種質庫大小模擬Fig.4 Simulating the size of cucumber core germplasm bank

3 結論與討論

針對黃瓜栽培種遺傳基礎狹窄、遺傳多樣性較低等問題，目前較為有效的方法是利用分子標記進行種質資源的遺傳分析。王佳等［23］利用ISSR分子標記對黃瓜種質資源進行了多態性檢測，雖不能按照生態型將現有黃瓜種質資源完全聚類，但總體而言，可以將其分為雌性型和普通型兩大類。李錫香等［24］利用RAPD技術對黃瓜種質資源進行了鑒定與分類，聚類分析結果能將不同來源國的種質較好地區分，但并不能很好地區分中國種質來源地不同的生態類型。李翔等［25］利用EST-SSR標記對39份云南地方黃瓜材料進行遺傳多樣性和親緣關系分析，發現云南地方黃瓜種質資源多樣性較豐富，聚類分析和主坐標分析所獲結果基本一致，為云南黃瓜種質資源保存與利用提供了依據。

隨著高通量測序技術的發展，InDel標記作為一種高通量遺傳標記，具有分布廣、重復性好、檢測方便、呈共顯性遺傳等優點，被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、高密度遺傳圖譜構建、基因定位、種子純度鑒定和分子標記輔助育種等研究領域［5］。在水稻遺傳育種中，相比于RAPD、RFLP等傳統分子標記，InDel標記技術在水稻秈粳屬性鑒定中準確率高，且快捷簡便［26］。張圣平等［16］研究獲得的InDel標記與Bt緊密相連，遺傳距離為0.8 cM，可應用于黃瓜果實無苦味MAS育種。蘭青闊等［14］基于InDel標記用焦磷酸測序技術對種子純度進行了鑒定，提高了鑒定的準確性和穩定性，并且更加高通量和自動化。本研究應用基于黃瓜重測序開發的InDel標記，分析了23份黃瓜種質的遺傳多樣性，UPGMA進化樹聚類方法、主成分分析和群體遺傳分析結果大致相同，將其分為三大類群。P1來源于亞洲，都是華南類型黃瓜。P2來源于歐洲和美國，大部分屬于歐洲類型黃瓜，包含歐洲長黃瓜和歐洲短黃瓜，但22號和23號是兩個加工型黃瓜，從表型看應屬于華南類型，但從親緣關系上與歐洲類型更為接近，說明其遺傳背景具有歐洲類型黃瓜基因。P3包含1個來源于廣東的種質，從表型看屬于華南類型，從親緣關系看更接近P1，但與P1的親緣關系有一定的差距，說明其遺傳基礎比較豐富，遺傳背景復雜。P1和P2分別屬于華南類型和歐洲類型，所以遺傳差異明顯。研究結果很好地反映了黃瓜種質間的形態相似性和地理區域的差異。

核心種質是以最少的種質樣品來最大程度地代表一個物種種質資源的遺傳多樣性，以方便種質資源的保存、管理及進一步的評價、利用。為了能夠獲得黃瓜核心種質的樣本量，研究者利用多種方法來構建核心種質資源庫。郭大龍等［27］應用M策略、遺傳距離法和Core hunter法構建葡萄的核心種質資源，M策略構建的核心種質能保留核心種質全部的等位基因。鄧學斌等［28］應用5種不同的方法（Mstrat、Random、REMC、SBS和SFS）構建了番茄10種初始核心種質資源，發現Mstrat是構建加工番茄亞群核心種質的最佳方法。Random隨機抽樣法得到的核心種質雖能有效保留原始種質的遺傳結構，但等位基因代表性較差［29］；REMC、SBS和SFS方法雖可100%覆蓋等位基因，但其核心群體結構代表性卻較差［30-31］。采用Mstrat方法構建遺傳背景狹窄的加工番茄亞群的核心種質，兼顧了群體結構和等位基因覆蓋度［11］。本研究利用InDel標記分析的結果，應用M策略將9份黃瓜種質確定為核心種質，能夠最大程度地覆蓋群體的等位基因。除此之外，進行核心種質構建時也加入了表型數據評價，各種質在表型上的多樣性也是建庫質量評價的重要指標，這9份核心種質包含了華南類型和歐洲類型，白刺、褐刺以及光滑無刺型，歐洲類型長黃瓜、歐洲類型短黃瓜以及加工黃瓜等，所以本研究構建的9份核心種質能夠很大范圍地覆蓋基因型和表型的變異。本研究所使用的試驗材料是經過多代純化形成的遺傳多樣性豐富和遺傳穩定的黃瓜自交系，更有利于核心種質在科研和育種中的直接利用。