大鱗副泥鰍腐皮病病原菌及其拮抗菌的分離篩選

楊喬喬，安賢惠，韓迎亞，馬 臻，朱 明,2，隆小華，李聯(lián)泰

( 1.淮海工學(xué)院，江蘇 連云港 222005； 2.連云港龍?jiān)瓷锟萍加邢薰荆K 連云港 222005；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095 )

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)，因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛，具有“水中人參”之美譽(yù)。連云港是全國(guó)最大的泥鰍養(yǎng)殖和出口基地，也是全國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)出口泥鰍質(zhì)量安全示范區(qū)。每年出口泥鰍約1×104t，產(chǎn)值逾4×107美元。大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)因其體型較大，生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，成為近年新興的養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，病害發(fā)生也愈加頻繁。其中泥鰍腐皮病是最為常見且危害較大的疾病之一。

泥鰍腐皮病傳染性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病率較高且危害大[1]，其癥狀為鰍體局部或全身潰瘍，表面分布大面積血斑，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)爛身、爛鰭、食欲不振等情況。更嚴(yán)重的是，病鰍死后，其內(nèi)臟系統(tǒng)受損，大部分沉入水底，或埋于淤泥，因此不能及時(shí)處理。只有尸體被泡脹后才能浮出水面，導(dǎo)致死鰍腹腔內(nèi)大量病菌擴(kuò)散至整個(gè)池塘，從而造成更大的污染和病原傳播[2]。關(guān)于泥鰍腐皮病病原的研究，僅見蕭克宇等[3]報(bào)道的溫和氣單胞菌(Aeromonadssobria)。

對(duì)腐皮病的防控和治療，目前主要依賴傳統(tǒng)的化學(xué)藥物(包括抗生素等)，其往往使病原菌產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果；藥物殘留也會(huì)干擾水產(chǎn)動(dòng)物腸道益生菌的生長(zhǎng)和繁殖；殘留在水體中的消毒劑和抗生素破壞養(yǎng)殖水環(huán)境，導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量降低[4]。有報(bào)道顯示，由于水產(chǎn)品藥物殘留導(dǎo)致出口受阻，給我國(guó)的水產(chǎn)品出口業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。利用拮抗菌來抑制病原菌的發(fā)生是一種環(huán)境友好型的病害防治方法。Kozasa[6]首次運(yùn)用1株自土壤中分離的東洋芽孢桿菌(Bacillustoyoi)處理鰻鱺(Anguillajaponica)，降低了由愛德華菌(Edwardsiella)引起的鰻鱺死亡率；趙淑江等[7]從南麂島近海海洋沉積物中篩選出86株放線菌，其中有5株海洋放線菌對(duì)大黃魚(Pseudosciaenacrocea)病原性弧菌——副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和哈維弧菌(V.harveyi)具有很強(qiáng)的抑制作用；Acurcio等[8]報(bào)道了3株腸球菌(Enterococcus)，其具有很強(qiáng)的益生菌特性，對(duì)酸性條件和膽汁有很好的耐受性，并且能夠抑制李斯特氏菌(Listeia)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等致病菌；張歡歡等[9]自對(duì)蝦養(yǎng)殖池篩選出1株假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)，對(duì)鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維弧菌及副溶血弧菌均有較強(qiáng)的抑制作用；何濤等[10]以草魚(Ctenopharyngodonidellus)病原菌維氏氣單胞菌(A.veronii)為指示菌，通過濾紙片抑菌圈法篩選出1株解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，對(duì)該病原菌有較好的拮抗效果。本試驗(yàn)擬從泥鰍池中分離泥鰍腐皮病病原菌，以此為指示菌分離篩選拮抗菌，以期為泥鰍腐皮病的防治及相關(guān)生物制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

患病泥鰍、水樣和泥樣，采自連云港市贛榆區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。

1.1.2 水產(chǎn)病原菌

溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、哈維弧菌、鰻弧菌、遲緩愛德華菌(E.tarda)(海水菌株)等為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.3 主要試劑

Tryptone、Yeast Extract(Oxoid LTD)，革蘭氏染色液、細(xì)菌生化微量鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)，PCR所用試劑[寶生物工程(大連)有限公司]，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、酸性磷酸酶(ACP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。引物合成及測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.4 LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L(液體培養(yǎng)基中不加)，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.1.5 主要儀器

PCR儀(5332，德國(guó)Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(OGGE，Bio-Rad公司)，紫外可見分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 泥鰍腐皮病病原菌的分離

先用70%酒精棉球擦拭病灶部位表面，用無菌小刀切取病鰍約黃豆大小的病灶組織，用無菌剪刀剪碎，放入提前準(zhǔn)備好的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h，然后用無菌生理鹽水10-1～10-6梯度稀釋，將10-4、10-5和10-6三個(gè)梯度分別涂布于LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，將明顯可見差異的單菌落挑出，通過三區(qū)劃線接種到LB培養(yǎng)基上，并進(jìn)行連續(xù)多次三區(qū)劃線，直至得到純培養(yǎng)物[11]。

1.2.2 病原菌的篩選及回歸感染

將1.2.1分離的純培養(yǎng)物分別接種至LB液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h后，采用分光光度法測(cè)定600 nm吸光度(OD600)，根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算各菌株的培養(yǎng)液密度[11]。

為提高感染率，用手術(shù)刀輕輕劃傷健康泥鰍表皮組織(注意不要損傷肌肉組織)，并迅速放入菌體密度為6×108cfu/mL的菌液中，浸泡15 min后，轉(zhuǎn)入未添加任何藥物的養(yǎng)殖水(3 kg/盒)中飼養(yǎng)[12]。觀察發(fā)病情況，篩選可感染腐皮病的病原菌株。

為進(jìn)一步確認(rèn)病原菌株，從試驗(yàn)中被感染的泥鰍病灶處，按照1.2.1方法再次分離病原菌并回歸感染健康泥鰍。每個(gè)菌株接種1組，每組設(shè)3個(gè)平行，每平行10尾泥鰍，以無菌LB培養(yǎng)基替代菌液為對(duì)照組。每個(gè)平行分別單獨(dú)計(jì)時(shí)，保證每個(gè)平行的泥鰍感染時(shí)間一致。

自人工感染并發(fā)病的泥鰍病灶處，再次進(jìn)行細(xì)菌分離，按照1.2.1的方法進(jìn)行。通過菌落形態(tài)和顯微鏡觀察，鑒定人工感染后分離的菌株與人工感染使用的菌株是否相同。

1.2.3 腐皮病拮抗菌的分離

采集連云港市贛榆區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司泥鰍養(yǎng)殖池水樣和底泥，用無菌生理鹽水按不同梯度稀釋，然后涂布到LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小、邊緣整齊度及透明度等特征的不同，用接種環(huán)挑取單菌落進(jìn)行劃線分離，直至得到純培養(yǎng)物。分別挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，測(cè)定OD600，根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算各菌株的培養(yǎng)液密度，作為待測(cè)菌液。

1.2.4 拮抗菌的初篩和復(fù)篩

采用濾紙片抑菌圈法進(jìn)行初篩[13]。接種病原菌于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)16 h。取10 μL培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至約40 ℃的LB固體培養(yǎng)基(約20 mL)，輕輕搖晃混勻。將直徑為6 mm的無菌濾紙片置于培養(yǎng)皿中，再將20 μL待測(cè)菌液滴加于濾紙片上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察測(cè)定抑菌圈大小。將出現(xiàn)抑菌圈的菌株再次復(fù)篩，篩選出抑菌圈較大而且穩(wěn)定出現(xiàn)的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(抑菌圈直徑用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)。

1.2.5 拮抗菌X8的傳代穩(wěn)定性

按1.2.4方法進(jìn)行操作。初代菌為分離純化保存的菌株。將初代菌重新三區(qū)劃線，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，為二代菌。以此類推。以初代抑菌圈直徑為100%，接種9代，分別做抑菌圈試驗(yàn)，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 病原菌和拮抗菌的菌株鑒定

1.2.6.1 形態(tài)特征觀察

群體形態(tài)觀察和個(gè)體形態(tài)觀察如革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、穿刺試驗(yàn)、細(xì)胞大小測(cè)定等均參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.2.6.2 生理生化試驗(yàn)

酪蛋白水解、明膠水解、淀粉水解和油脂水解等大分子水解試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。微量生化管鑒定試驗(yàn)按杭州微生物試劑有限公司《細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書》操作和觀察記載。

1.2.6.3 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本試驗(yàn)采用菌落PCR，從病原菌三區(qū)劃線平板上挑取單菌落，加入1 mL的無菌水，混勻后煮沸5 min，5000 r/min離心3 min，取上清液作為PCR反應(yīng)的模板。擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rRNA基因序列通用引物27F和1492R。反應(yīng)體系：50 U Taq酶0.5 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.5 μL，100 μmol/L引物各0.5 μL，模板1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，復(fù)性55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，變性—復(fù)性—延伸30個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，在EZ.BioCloud網(wǎng)站查找模式菌株序列并下載，在Mega 6.06軟件中比對(duì)序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 拮抗菌X8對(duì)不同溫度的適應(yīng)性

以0.5%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，分別置于20、25、30、35、40 ℃搖床中，180 r/min培養(yǎng)36 h。分別取20 μL發(fā)酵液，滴加于無菌濾紙片上，再將濾紙片置于混有病原菌的LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察測(cè)定抑菌圈大小。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 拮抗菌X8對(duì)不同鹽度的適應(yīng)性

以0.5%的接種量分別接種至鹽度為0、10、20、30、40、50的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。按照1.2.7的方法進(jìn)行操作。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 拮抗菌X8對(duì)泥鰍生理指標(biāo)的影響

1.2.9.1 體長(zhǎng)和體質(zhì)量增加量的測(cè)定

將泥鰍分為試驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行15尾泥鰍，平均體長(zhǎng)(13.2±0.3) cm，體質(zhì)量(10.1±0.2) g，置于直徑20 cm、高10 cm的飼養(yǎng)盒中，每盒保持1 L的水量。每隔2 d換水1次。水溫為(23±1) ℃。每日稱取泥鰍體質(zhì)量，按體質(zhì)量的2%進(jìn)行投食，早晚各1次。拮抗菌X8以0.5%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)36 h，制成菌液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，得到菌液密度。試驗(yàn)組加入1 mL菌液，使得水體中拮抗菌的密度達(dá)到105cfu/mL數(shù)量級(jí)。對(duì)照組加入1 mL無菌LB液體培養(yǎng)基。換水后，試驗(yàn)組和對(duì)照組重新添加菌液和無菌LB液體培養(yǎng)基。觀察期為28 d，觀察每組泥鰍的生長(zhǎng)狀況，測(cè)量各組總體長(zhǎng)和總體質(zhì)量(15尾合計(jì))，計(jì)算觀察期內(nèi)，總體長(zhǎng)和總體質(zhì)量的增加值，分析試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異情況。

1.2.9.2 超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活性的測(cè)定

28 d觀察期結(jié)束后，將各組泥鰍斷尾取血，離心后取血清，-20 ℃保存。超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活性的測(cè)定均按照測(cè)試盒說明書進(jìn)行。

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

1.2.10 拮抗菌X8對(duì)不同水產(chǎn)病原菌的拮抗作用

活化本實(shí)驗(yàn)室保存的幾株水產(chǎn)致病性菌株：維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌、哈維弧菌、鰻弧菌。采用濾紙片抑菌圈法(無菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照)，按照1.2.4進(jìn)行操作。觀察并測(cè)量抑菌圈大小。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

自患病泥鰍體表病灶處采樣，共分離出25個(gè)純培養(yǎng)物。編號(hào)分別是D1-1，D1-2-1，D1-2-2，…，D5-7，…，D7。

2.2 病原菌的篩選和回歸感染

2.2.1 病原菌的篩選

將上述分離到的25個(gè)純培養(yǎng)物，按方法1.2.2感染健康泥鰍，其中只有編號(hào)為D5-7的菌株可誘發(fā)泥鰍出現(xiàn)腐皮、爛身等典型的腐皮病癥狀，因此初步確定D5-7為病原菌株。

2.2.2 回歸感染

為進(jìn)一步證明菌株D5-7為泥鰍腐皮病的病原菌，再次自菌株D5-7引起發(fā)病的病灶部位取樣，按1.2.2的方法進(jìn)行分離和感染，同樣出現(xiàn)了與自然患病相同的腐皮病特征(圖1)。人工感染試驗(yàn)后，取發(fā)病泥鰍的病灶組織進(jìn)行分離，確實(shí)分離到與D5-7形態(tài)特性一致的菌株，表明菌株D5-7為泥鰍腐皮病的病原菌。

圖1 感染腐皮病的泥鰍

2.3 拮抗菌的分離

自泥鰍養(yǎng)殖池水和底泥采集的樣品經(jīng)過稀釋涂布、三區(qū)劃線，共分離出11株菌株，編號(hào)分別為L(zhǎng)11、L12、L13、L14、L15、L17、L18、L19、L20、H25、X8。

2.4 拮抗菌的篩選

2.4.1 拮抗菌的初篩和復(fù)篩

按1.2.4方法進(jìn)行操作，結(jié)果見圖2a，菌株L11、X8、L18、H25出現(xiàn)抑菌圈，直徑分別為(11.2±0.11) mm、(14.2±0.10) mm、(11.9±0.10) mm、(9.9±0.20) mm。將出現(xiàn)抑菌圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩，篩選出抑菌圈較大且穩(wěn)定出現(xiàn)的菌株X8進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖2b)。

圖2 拮抗菌的初篩(a)和拮抗菌的復(fù)篩(b)

2.4.2 拮抗菌的傳代穩(wěn)定性

按1.2.4方法進(jìn)行操作。以初代抑菌圈直徑為100%，接種9代，抑菌圈直徑分別為初代的105%、109%、106%、96%、95%、94%、107%、111%、110%，證明X8的抑菌活性能夠穩(wěn)定傳代。

2.5 病原菌和拮抗菌的菌株鑒定

2.5.1 形態(tài)特征觀察

在LB平板上將病原菌D5-7三區(qū)劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察。菌株D5-7菌落呈淡黃色，圓形，中央鼓起，邊緣整齊，光滑，半透明或接近不透明；革蘭氏染色后菌體呈紅色(圖3)，可以判斷菌株D5-7為革蘭氏陰性細(xì)菌。顯微觀察其大小為(1.43±0.19) μm×(0.7±0.08) μm；無芽孢，無莢膜。穿刺試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株D5-7無運(yùn)動(dòng)性。

在LB平板上將拮抗菌X8三區(qū)劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察。菌株X8菌落呈淡黃色，多邊形，邊緣不整齊，表面干燥不平滑，不透明；革蘭氏染色呈紫色(圖4)，可以判斷菌株X8為革蘭氏陽性細(xì)菌。顯微觀察其大小為(2.99±0.28) μm×(1.17±0.17) μm；有芽孢，無莢膜。穿刺試驗(yàn)結(jié)果表明菌株X8無運(yùn)動(dòng)性。

圖3 菌株D5-7的菌落形態(tài)(a)和革蘭氏染色結(jié)果(b)

圖4 菌株X8的菌落形態(tài)(a)和革蘭氏染色結(jié)果(b)

2.5.2 生理生化試驗(yàn)

2.5.2.1 大分子水解試驗(yàn)

以短小芽孢桿菌(B.pumilus)E14[15]為對(duì)照進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，病原菌D5-7具有降解酪蛋白、明膠等蛋白質(zhì)的能力，但不能降解淀粉和油脂(圖5)。拮抗菌X8具有水解淀粉和明膠的能力，不能水解酪蛋白、油脂(圖6)。

圖5 病原菌D5-7的蛋白水解試驗(yàn)

圖6 拮抗菌X8的淀粉和明膠水解試驗(yàn)

2.5.2.2 菌株D5-7和菌株X8的生理生化反應(yīng)

菌株D5-7和菌株X8的生理生化反應(yīng)見表1和表2。菌株D5-7能夠利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖等，不能利用丙二酸鹽、鼠李糖、阿拉伯醇、蜜二糖等。菌株X8能夠利用纖維二糖、葡萄糖、氰化鉀、丙二酸鹽等，不能利用果糖、乳糖、半乳糖、甘露醇等。

2.5.3 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

擴(kuò)增菌株D5-7和X8的16S rRNA基因，16S rRNA基因片段大小約為1500 bp。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

利用EZ.BioCloud網(wǎng)站查找模式菌株序列并下載，用Mega 6.06軟件采用臨接法(重復(fù)數(shù)為1000，步長(zhǎng)值取百分比)分別構(gòu)建菌株D5-7和X8的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖7、圖8)。

由圖7可知，病原菌D5-7與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeromonadssalmonicidassp.salmonicida) ATCC 33658遺傳距離最近，同源性為98%。綜合菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rRNA基因序列分析，將病原菌D5-7鑒定為氣單胞菌屬殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

由圖8可知，拮抗菌X8與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)D15遺傳距離最近，同源性為98%。綜合菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rRNA基因序列分析，將拮抗菌X8鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

表1 病原菌D5-7微量生化管反應(yīng)結(jié)果

表2 拮抗菌X8微量生化管反應(yīng)結(jié)果

圖7 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株D5-7(LC312129)的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株X8(MH128163)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)不同溫度的適應(yīng)性

解淀粉芽孢桿菌X8在20～40 ℃之間具有抑菌活性(圖9)。在30 ℃時(shí)，抑菌活性達(dá)到最高，抑菌圈直徑達(dá)(16.6±0.35) mm。

圖9 不同溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌X8拮抗活性的影響柱形圖上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

2.7 解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)不同鹽度的適應(yīng)性

解淀粉芽孢桿菌X8在鹽度0～50之間具有抑菌活性(圖10)。在鹽度為0時(shí)，抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)(21.7±0.18) mm。隨著鹽度的上升抑菌活性逐漸降低，在鹽度為50時(shí)，抑菌活性最低，抑菌圈直徑僅為(10.1±0.37) mm。說明解淀粉芽孢桿菌X8在鹽度0～50內(nèi)具有較好的適應(yīng)性。

2.8 解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)泥鰍生理指標(biāo)的影響

觀察期間，試驗(yàn)組與對(duì)照組泥鰍全部存活(表3)。體長(zhǎng)(cm)和體質(zhì)量(g)為試驗(yàn)前后增加的數(shù)值。試驗(yàn)組泥鰍的體長(zhǎng)和體質(zhì)量的增加值明顯大于對(duì)照組，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，推測(cè)原因，可能是解淀粉芽孢桿菌X8抑制了水體中病原菌的生長(zhǎng)，改善了生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)了泥鰍的健康生長(zhǎng)。

圖10 不同鹽度對(duì)解淀粉芽孢桿菌X8拮抗活性的影響

超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶是魚類重要的兩個(gè)免疫指標(biāo)。試驗(yàn)組與對(duì)照組泥鰍血清中超氧化物歧化酶活性有所差別，但未達(dá)顯著水平(P>0.05)。試驗(yàn)組泥鰍血清中的酸性磷酸酶活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。酸性磷酸酶作為體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，主要存在于各臟器、血細(xì)胞和骨髓中[16]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組酸性磷酸酶的增高，說明解淀粉芽孢桿菌X8可提高泥鰍的免疫力。

表3 解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)泥鰍生理指標(biāo)的影響

2.9 解淀粉芽孢桿菌X8的拮抗譜

解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、遲緩愛德華菌、哈維弧菌、鰻弧菌有拮抗性(圖11)，抑菌圈直徑分別達(dá)(14.7±0.10) mm、(16.8±0.15) mm、(11.3±0.20) mm、(15.9±0.15) mm、(8.2±0.05) mm、(11.8±0.10) mm、(8.2±0.08) mm。

圖11 解淀粉芽孢桿菌X8對(duì)不同病原菌的抑制作用a.氣單胞菌，b.海水菌. CK為對(duì)照.

3 討 論

3.1 腐皮病病原菌的研究

誘發(fā)腐皮病的細(xì)菌性病原有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌和點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種(A.punctatassp.punctata)等[3,17-18]。泥鰍腐皮病傳染性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病率較高且危害大，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19-20]。目前，關(guān)于泥鰍腐皮病病原菌，僅見蕭克宇等[3]報(bào)道的溫和氣單胞菌。本研究分離的殺鮭氣單胞菌也可誘發(fā)泥鰍腐皮病，目前尚未見報(bào)道。

殺鮭氣單胞菌屬氣單胞菌科、氣單胞菌屬，是一種引起鮭科魚類發(fā)生癤瘡病即腐皮病的典型細(xì)菌性病原[21]。1894年，Emmerich等[22]首次自患病溪鱒(Salvelinusfontinalis)中分離出該菌。其廣泛分布于淡水河流、湖泊、池塘等多種水環(huán)境，除美國(guó)南部地區(qū)以外，世界各地均有發(fā)現(xiàn)。近年來，被殺鮭氣單胞菌感染的水產(chǎn)動(dòng)物有半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[23]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[24]、大西洋鮭(Salmosalar)[25]、細(xì)鱗魚(Brachymystaxlenok)[26]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[27]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[28]、石鰈(Kareiusbicoloratus)[29]等，臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減退，伴有出血性紅點(diǎn)，嚴(yán)重者體表形成膿腫或潰瘍。本試驗(yàn)患病泥鰍除了上述病癥外，還出現(xiàn)鱗片脫落和臟器外露等癥狀。殺鮭氣單胞菌感染泥鰍的研究，擴(kuò)大了對(duì)殺鮭氣單胞菌可感染水生生物種類的認(rèn)知范圍。

3.2 腐皮病的誘發(fā)因素

誘發(fā)泥鰍腐皮病的主要因素有兩種：一是劃傷，二是溫度。當(dāng)泥鰍養(yǎng)殖池淤泥過多、池塘水質(zhì)不良、施用未經(jīng)充分發(fā)酵的糞肥，或在捕撈、運(yùn)輸過程中操作不慎引起鰍體受傷，導(dǎo)致泥鰍體表黏膜脫落或損傷，即可引起病原菌大量滋生。病原菌自泥鰍的受傷皮膚入侵，感染發(fā)病[18,30]。另外泥鰍腐皮病也為季節(jié)性發(fā)作病害，據(jù)初步觀察，江蘇連云港養(yǎng)殖泥鰍的發(fā)病時(shí)間通常為初春和秋末(即4—5月和9—10月)，此時(shí)養(yǎng)殖池水溫通常為22～27 ℃，當(dāng)氣溫高于30 ℃時(shí)，病情自然減弱直至消失。由此推測(cè)，大鱗副泥鰍腐皮病的發(fā)生與溫度密切相關(guān)，鰻鱺[31]的研究也有類似的情況。本試驗(yàn)篩選出的拮抗菌X8的適應(yīng)溫度為20～40 ℃，在生產(chǎn)上有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 拮抗菌X8為一種多功能菌株

近年來，以拮抗菌為代表的生物防治方法，具有環(huán)境友好、綠色安全等特點(diǎn)，已受到越來越多的關(guān)注，不僅可以有效防治病害發(fā)生，還有助于改善水質(zhì)，減少環(huán)境污染[32]。目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用拮抗菌防治水產(chǎn)病害的報(bào)道較多，用來防治殺鮭氣單胞菌的研究也有報(bào)道[33-34]，但使用拮抗菌防治泥鰍腐皮病的研究尚未見報(bào)道。筆者以殺鮭氣單胞菌D5-7為指示菌，自大鱗副泥鰍養(yǎng)殖池水樣中篩選并鑒定出1株拮抗菌——解淀粉芽孢桿菌X8，其抑菌圈直徑達(dá)(14.2±0.10) mm。該菌株的獲得，進(jìn)一步豐富了防治水產(chǎn)病害的拮抗菌資源。

有研究表明，解淀粉芽孢桿菌是重要的生防細(xì)菌，抑菌活性非常廣泛[35-36]。張雪等[37]研究表明，牛瘤胃源解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、副溶血弧菌、藤黃八疊球菌(Sarcinalutea)和產(chǎn)氣桿菌(E.aerogenes)等細(xì)菌以及黑曲霉(Aspergillusniger)、黑根霉(Rhizopusnigricans)等霉菌均具有抑制作用。孫梅等[38]篩選出的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA，對(duì)多種水產(chǎn)病原菌如嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)均具有一定的抑制作用，其中對(duì)溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌的抑制效果顯著。本研究分離的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌X8不僅對(duì)引起腐皮病的殺鮭氣單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)其他水產(chǎn)病原菌如維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華菌、哈維弧菌、鰻弧菌等也有一定的拮抗作用。哈維弧菌、遲緩愛德華菌、鰻弧菌感染一般發(fā)生在鹽度為10～30的海水環(huán)境[39]，解淀粉芽孢桿菌X8在鹽度40以下均對(duì)其有一定的抑菌活性。這與田良[40]的研究結(jié)果一致。另外，解淀粉芽孢桿菌被認(rèn)為是一種安全性較高的菌種，有望開發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖專用微生物制劑[41]。

解淀粉芽孢桿菌X8不僅對(duì)上述水產(chǎn)病害具有抑制作用，而且對(duì)泥鰍生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組比對(duì)照組體長(zhǎng)增加1.40 cm，體質(zhì)量增加2.44 g，酸性磷酸酶提高0.18 U/mL，三者均達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)。因此該菌株在生產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。