中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

林建城，王麗英，林娟娟

( 莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100 )

Broadway等[1]根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理不同，認(rèn)為其至少包含內(nèi)切幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)、外切幾丁質(zhì)酶和具外切酶性質(zhì)的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)等3種組分。微生物幾丁質(zhì)酶已受到廣泛關(guān)注[2]，它能夠?qū)⒄婢?xì)胞壁、昆蟲體表和圍食膜的幾丁質(zhì)成分水解為幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，從而能有效抑制真菌的生長(zhǎng)和加速害蟲的死亡進(jìn)程[3]；而在甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)中必須經(jīng)過(guò)一個(gè)周期性的動(dòng)態(tài)生理過(guò)程——蛻皮[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)酶與其周期性蛻皮生理之間存在相關(guān)性[5]。Buchholz[6]研究表明，南極磷蝦(Euphausiasuperba)蛻皮與外殼幾丁質(zhì)酶活力變化相關(guān)，在蛻皮前短時(shí)間內(nèi)，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大量合成，酶活力迅速提高，用于降解蝦幾丁質(zhì)表皮；樸順金等[7]在研究不同養(yǎng)殖期凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)外殼膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)，在蝦幼體和生殖期時(shí)，由于蛻殼頻繁，蝦外殼膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶比活力會(huì)迅速升高。而Koga等[8]從家蠶(Bombyxmori)的表皮層中獲得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，發(fā)現(xiàn)蠶表皮N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶與其周期性的蛻皮生理、以及生活周期中蛹的形成密切相關(guān)。Arakane等[9]也發(fā)現(xiàn)昆蟲內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可將其自身幾丁質(zhì)表皮降解為殼寡糖，再由外切幾丁質(zhì)酶繼續(xù)降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體，并用以形成新的表皮。此后，王佩等[10]研究表明，日本沼蝦幾丁質(zhì)酶基因-3的表達(dá)水平以蛻皮前期最為顯著，從而推測(cè)與幾丁質(zhì)酶參與蝦舊殼的降解和新殼的形成有關(guān)，進(jìn)一步證明了幾丁質(zhì)酶在甲殼動(dòng)物蛻皮生理中起重要作用。

中國(guó)鱟(Tachypleustridentatus)屬節(jié)肢動(dòng)物門、肢口綱、劍尾目，由于海域環(huán)境破壞和人類捕殺等原因，已成為瀕危物種，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。隨著沿海地區(qū)工業(yè)化的不斷推進(jìn)，鱟賴以生存的海域環(huán)境受到嚴(yán)重破壞，擾亂了鱟的正常生理活動(dòng)與物質(zhì)代謝。有研究表明，溫度和鹽度都會(huì)影響中國(guó)鱟胚胎發(fā)育的速度和孵化率，其胚胎發(fā)育最適溫度為28 ℃，最適鹽度為20[11]；而Zn、Pb、Cu和Cd 4種重金屬離子對(duì)中國(guó)鱟的胚胎發(fā)育產(chǎn)生的影響不同，當(dāng)4種重金屬離子濃度超過(guò)漁業(yè)水域水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度8倍時(shí)，Cd2+和Cu2+對(duì)鱟的胚胎發(fā)育無(wú)明顯影響，但Zn2+和Pb2+會(huì)使鱟胚胎發(fā)育中卵徑變小，發(fā)育速度下降[12]，說(shuō)明海洋環(huán)境因子的變化直接影響中國(guó)鱟的胚胎發(fā)育和幼體生長(zhǎng)。此外，有研究表明，溫度、酸堿度、金屬離子和有機(jī)溶劑等環(huán)境因素對(duì)節(jié)肢動(dòng)物幾丁質(zhì)酶會(huì)產(chǎn)生重要影響，并推測(cè)會(huì)影響節(jié)肢動(dòng)物的蛻皮生理[13-15]。而在中國(guó)鱟的胚胎發(fā)育到性成熟期間，至少需經(jīng)19次蛻皮，鱟蛻皮生理的變化直接影響鱟的正常生長(zhǎng)發(fā)育。然而，中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的生理特性及環(huán)境因子對(duì)鱟幾丁質(zhì)酶的影響，目前尚未見相關(guān)研究。之前研究已自中國(guó)鱟內(nèi)臟中分離純化出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶[16]，現(xiàn)繼續(xù)自中國(guó)鱟內(nèi)臟中分離提取內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶，探討其酶學(xué)性質(zhì)，并研究環(huán)境因子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的影響，這對(duì)進(jìn)一步揭示鱟幾丁質(zhì)酶與蛻皮生理之間的相關(guān)性具有重要的作用，并為能更好地保護(hù)鱟資源，合理開發(fā)利用鱟資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國(guó)鱟購(gòu)自莆田市城南市場(chǎng)。酶催化的底物對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成；3,5-二硝基水楊酸為Fluka產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)物N-乙酰-D-氨基葡萄糖為Sigma產(chǎn)品，幾丁質(zhì)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶制劑的制備

取新鮮中國(guó)鱟內(nèi)臟，以1∶3(m/V)浸泡在預(yù)冷的0.01 mol/L Tris-HCl(pH 5.4)緩沖液中，在高速組織搗碎機(jī)中破碎1 min，4 ℃抽提4 h以上，勻漿液于4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，取上清液。上清液依次采用35%、75%飽和度的(NH4)2SO4分級(jí)分離，沉淀物經(jīng)雙蒸餾水透析后于4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，上清液為粗酶制劑。

1.2.2 膠體幾丁質(zhì)的制備

將條狀幾丁質(zhì)(甲殼素)在植物粉碎機(jī)下磨成細(xì)粉，10 g細(xì)粉幾丁質(zhì)加入100 mL濃鹽酸，4 ℃下間隔攪拌24 h，倒入500 mL預(yù)冷蒸餾水中，放置48 h，4000 r/min下離心，沉淀用蒸餾水洗至中性，用的50 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.4)配成5.0 mg/mL的膠體幾丁質(zhì)。

1.2.3 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定方法

中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]，在0.5 mL的酶活力測(cè)定體系中含有50 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.4)和5.0 mg/mL膠體幾丁質(zhì)，55 ℃下預(yù)熱10 min，后加入50 μL的酶液，在55 ℃下反應(yīng)30 min；以0.5 mL 0.5 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，離心，去沉淀，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸，煮沸5 min，靜置至室溫后，測(cè)定其光吸收值(A520nm)，以未加入酶制劑的為對(duì)照。以產(chǎn)物N-乙酰-D-氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值(y)為縱坐標(biāo)，N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程：y=0.619x-0.151。

1個(gè)酶活力單位(U)定義為：每小時(shí)水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.4 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶最適pH和酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

在酶活力測(cè)定體系中，測(cè)定不同pH(3.6～9.0)下中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力，其中pH為3.6～5.8時(shí)選擇HAC-NaAC緩沖液，pH為5.8～7.6時(shí)采用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH為7.6～9.0時(shí)使用Tris-HCl緩沖液，3種緩沖液濃度均為50 mmol/L，酶活力最大的試驗(yàn)組其pH值確定為酶的最適pH，其酶活力以100%表示，其余各試驗(yàn)組酶活力則以相對(duì)酶活力表示。

將酶液分別與各種不同pH(3.6～9.0)的緩沖液混合，4 ℃下各預(yù)處理1 h，然后取50 μL處理過(guò)的酶液，在酶活力測(cè)定體系中測(cè)定酶經(jīng)處理后的剩余酶活力，剩余酶活力最大的試驗(yàn)組其酶活力以100%表示，其余試驗(yàn)組的酶活力以相對(duì)酶活力表示，以分析幾丁質(zhì)酶的酸堿穩(wěn)定性。

相對(duì)酶活力/%=(a/amax)×100%

式中，a為各試驗(yàn)組(剩余)酶活力，amax為各試驗(yàn)組中最大(剩余)酶活力。

1.2.5 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

在酶活力測(cè)定體系中，檢測(cè)不同溫度(20～90 ℃)下中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力，酶活力最大的試驗(yàn)組其溫度確定為酶的最適溫度，其酶活力以100%表示，其余試驗(yàn)組的酶活力以相對(duì)酶活力表示。

將幾丁質(zhì)酶液置于不同溫度(20～90 ℃)下預(yù)處理1 h，然后取50 μL經(jīng)熱處理過(guò)的酶，在酶活力測(cè)定體系中測(cè)定酶經(jīng)熱處理后的剩余酶活力，剩余酶活力最大的試驗(yàn)組其酶活力以100%表示，其余試驗(yàn)組的剩余酶活力以相對(duì)酶活力表示，以分析幾丁質(zhì)酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.6 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)酶解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定體系中，改變底物膠體幾丁質(zhì)的質(zhì)量濃度，測(cè)定不同底物質(zhì)量濃度[S](2.0～8.0 mg/mL)下幾丁質(zhì)酶活力，采用Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖法，以反應(yīng)初速度倒數(shù)(1/v)對(duì)底物質(zhì)量濃度倒數(shù)(1/[S])作圖，求出中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)。

1.2.7 金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力影響的測(cè)定

在上述幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定體系中，分別加入0～20.0 mmol/L的Li2SO4、Na2SO4、NaCl、NaNO3和KNO3；0～5.0 mmol/L的MgSO4、CaCl2和BaCl2；0～20.0 mmol/L的FeSO4、CoCl2、NiCl2、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、AlCl3、FeCl3、HgCl2、Pb(NO3)2和Cd(NO3)2；測(cè)定加入各金屬離子后的中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力。以未添加金屬離子的對(duì)照組酶活力為100%，計(jì)算各試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

相對(duì)酶活力/%=(a/amax)×100%

式中，a為各試驗(yàn)組酶活力，amax為對(duì)照組酶活力。

1.2.8 有機(jī)溶劑對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力影響的測(cè)定

在幾丁質(zhì)酶測(cè)活體系中，分別加入0～50.0%體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、二氧六環(huán)和二甲亞砜等7種有機(jī)溶劑，以未添加有機(jī)溶劑的對(duì)照組酶活力為100%，計(jì)算各試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

由圖1可見，pH對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響呈鐘罩型曲線變化，幾丁質(zhì)酶最適pH為5.4，隨pH逐漸增大，幾丁質(zhì)酶活力也不斷下降。

圖1 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的最適pH

由圖2可見，幾丁質(zhì)酶在pH 4.6～6.0的緩沖液中預(yù)處理1 h后，相對(duì)酶活力還保留在80.7%以上，說(shuō)明幾丁質(zhì)酶在pH 4.6～6.0內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)pH 8.0緩沖液處理1 h后幾丁質(zhì)酶相對(duì)活力僅有11.5%；而在pH≤4.4的緩沖液中處理后幾丁質(zhì)酶活力也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶對(duì)環(huán)境中酸堿度的變化敏感。

圖2 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的酸堿穩(wěn)定性

2.2 溫度對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

由圖3可見，中國(guó)鱟內(nèi)臟幾丁質(zhì)酶的最適溫度為55 ℃，之后隨溫度升高酶活力不斷下降，溫度達(dá)80 ℃時(shí)，酶活力剩余36.6%。

圖3 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的最適溫度

由圖4可見，幾丁質(zhì)酶在20～60 ℃預(yù)處理1 h后相對(duì)酶活力保持在88%以上，酶在65 ℃處理1 h相對(duì)酶活力還保留有79.8%，在90 ℃下處理1 h相對(duì)酶活力還剩34.3%，表明中國(guó)鱟內(nèi)臟幾丁質(zhì)酶具較好的熱穩(wěn)定性。

2.3 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度的測(cè)定

Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖(圖5)顯示，反應(yīng)初速度倒數(shù)(y)與底物濃度倒數(shù)(x)的回歸方程為y=1.494x+0.687，求得催化膠體幾丁質(zhì)底物水解的中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶米氏常數(shù)為2.175 mg/mL，最大反應(yīng)速度為1.456 μmol/(mL·min)。

圖4 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的溫度穩(wěn)定性

圖5 中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶米氏常數(shù)米氏常數(shù)的測(cè)定

2.4 金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.4.1 正一價(jià)金屬離子對(duì)酶活力的影響

2.4.2 堿土金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖6可見，在0～5.0 mmol/L濃度內(nèi)，堿土金屬離子Ca2+和Ba2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有微弱的激活作用，1.0 mmol/L Ca2+和Ba2+可分別使酶活力提高10.1%、11.3%，但Mg2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力影響不大。

2.4.3 過(guò)渡金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖7可見，過(guò)渡金屬離子Fe2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力影響不大；而Co2+在低濃度時(shí)對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶先表現(xiàn)為激活，后隨Co2+濃度增大逐漸轉(zhuǎn)為抑制作用，5 mmol/L Co2+可使幾丁質(zhì)酶活力提高16.3%，而20 mmol/L Co2+則可使酶活力下降14.3%。Ni2+和Mn2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力均呈抑制作用，10 mmol/L的Ni2+和Mn2+可分別使幾丁質(zhì)酶活力下降27.4%和41.6%。

圖6 正二價(jià)堿土金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

圖7 過(guò)渡金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.4.4 正三價(jià)金屬離子對(duì)酶的效應(yīng)

由圖8可見，低濃度的Fe3+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有微弱的激活作用，但隨Fe3+濃度的增大對(duì)幾丁質(zhì)酶反而有微弱的抑制作用，5 mmol/L Fe3+能使幾丁質(zhì)酶活力提高4.3%，而20 mmol/L Fe3+對(duì)幾丁質(zhì)酶抑制了9.2%。Al3+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力具有一定的抑制作用，10 mmol/L的Al3+可使幾丁質(zhì)酶活力下降18.6%。

2.4.5 重金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖9可見，低濃度的Cu2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有微弱的激活作用，但隨Cu2+濃度的增大逐漸呈現(xiàn)出對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制作用，10 mmol/L Cu2+能使幾丁質(zhì)酶活力下降39.5%；而Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+等重金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶均呈不同程度的抑制作用，10 mmol/L的Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+可分別使幾丁質(zhì)酶活力抑制17.5%、23.9%、33.1%和83.0%，Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制作用最強(qiáng)。

圖8 Fe3+和Al3+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.5 有機(jī)溶劑對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

由表1可見，甲醇、乙醇、異丙醇和正丙醇對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶均有抑制作用，抑制作用順序?yàn)榧状?乙醇>異丙醇>正丙醇；丙酮對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有一定的激活作用，10%體積分?jǐn)?shù)的丙酮會(huì)使酶活力提高16.0%；二氧六環(huán)和二甲亞砜在低濃度時(shí)對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有激活作用，隨濃度升高，對(duì)幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)為抑制作用，2%體積分?jǐn)?shù)的二氧六環(huán)和二甲亞砜可分別使幾丁質(zhì)酶活力提高7.7%和14.5%，而其在30%體積分?jǐn)?shù)時(shí)，可分別使幾丁質(zhì)酶活力下降11.3%和23.1%。

圖9 重金屬離子對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的影響

表1 7種有機(jī)溶劑對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶相對(duì)酶活力的影響 %

3 討 論

3.1 幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性

不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶對(duì)酸堿敏感度不同。凡納濱對(duì)蝦[15]幾丁質(zhì)酶酸堿穩(wěn)定性區(qū)域?yàn)閜H 4.6～7.0；而蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensisssp.colmeri)15A3[3]幾丁質(zhì)酶B酸堿穩(wěn)定在pH 4.0～8.0。馮金榮等[17]研究的伊薩酵母(Issatchenkiaterricola)幾丁質(zhì)酶在pH 5.0～9.0內(nèi)較為穩(wěn)定，pH超出此范圍，酶將迅速失活。在本研究中，中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶在pH 4.6～6.0內(nèi)較為穩(wěn)定，在pH>6.5和pH<4.5下酶失活加快，對(duì)酸堿較為敏感。

蠶蛹(Bombyxmori)[18]幾丁質(zhì)酶在溫度45 ℃以上時(shí)酶失活速度加快；毛殼菌(Chaetomiumsp.)YMF1.00843[19]幾丁質(zhì)酶在溫度高于40 ℃時(shí)易失活，酶穩(wěn)定性較差。Kopparapu等[20]也從石榴(Punicagranatum)果汁中分離純化到一種熱穩(wěn)定性很好的幾丁質(zhì)酶，溫度在65 ℃內(nèi)酶基本穩(wěn)定。而中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶則具有較好的熱穩(wěn)定性，在20～60 ℃溫度內(nèi)酶基本穩(wěn)定，60 ℃處理1 h后酶活力還保留88%，相比中國(guó)鱟外切型幾丁質(zhì)酶——N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，溫度穩(wěn)定性范圍為20～50 ℃，兩者最適溫度均為55 ℃[16]，因此，在鱟幼體生長(zhǎng)的適宜水溫(30 ℃左右)下，中國(guó)鱟內(nèi)切和外切幾丁質(zhì)酶活力均較低。

3.2 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶的影響

Li+和K+對(duì)海洋微生物短芽孢桿菌(Brevibacillussp.)Bsp1[21]幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的激活作用，可分別使酶活力提高17%和3%，Na+對(duì)其又有微弱的抑制作用；而Li+對(duì)蘇云金芽孢桿菌[3]幾丁質(zhì)酶B則呈現(xiàn)一定的抑制作用，Na+對(duì)其又有微弱的激活效應(yīng)。此外，Na+和K+對(duì)中華根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)L03[22]幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用；5 mmol/L Na+和K+可分別使疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)[23]幾丁質(zhì)酶活力提高45.6%和30.4%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，K+、Na+和Li+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶幾乎沒(méi)有影響。

堿土金屬離子常對(duì)酶呈激活效應(yīng)。Ca2+和Mg2+對(duì)毛殼菌[19]和芽孢桿菌(Bacillussp.)Hu1[24]幾丁質(zhì)酶均有激活作用；50 mmol/L Mg2+和Ba2+可顯著提高中華根瘤菌[22]幾丁質(zhì)酶的活性，Ca2+對(duì)其則呈現(xiàn)抑制作用。而Ca2+和Ba2+對(duì)凡納濱對(duì)蝦[15]幾丁質(zhì)酶活性也有一定激活作用，Mg2+對(duì)其卻沒(méi)有影響，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，1.0 mmol/L Ca2+和Ba2+可分別使中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力提高10.1%和11.3%，但Mg2+對(duì)酶活力影響不大。

過(guò)渡金屬離子對(duì)酶活性的影響呈現(xiàn)多樣性。Fe2+、Mn2+和Co2+對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcesens)[25]幾丁質(zhì)酶有不同效應(yīng)，F(xiàn)e2+表現(xiàn)明顯的抑制作用，Mn2+有微弱激活作用，Co2+又幾乎沒(méi)有影響；5 mmol/L Co2+可以使短芽孢桿菌[21]幾丁質(zhì)酶活性提高1.4倍，Ni2+對(duì)其則表現(xiàn)為抑制作用；而5 mmol/L濃度的Mn2+、Co2+和Fe2+對(duì)重組幾丁質(zhì)酶rchiGR52-1[26]均有明顯的抑制作用，Ni2+對(duì)其又具有一定的促進(jìn)作用。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)e2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力影響不大，低濃度Co2+對(duì)酶表現(xiàn)為激活效應(yīng)，之后隨濃度增大轉(zhuǎn)為抑制作用，Ni2+和Mn2+對(duì)酶具有不同程度的抑制作用。

Fe3+對(duì)毛殼菌[19]幾丁質(zhì)酶影響不大，對(duì)蘇云金芽孢桿菌[3]幾丁質(zhì)酶B活性有促進(jìn)作用，但又強(qiáng)烈抑制中華根瘤菌[22]幾丁質(zhì)酶的活性。在本試驗(yàn)中，低濃度Fe3+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶有微弱的激活效應(yīng)，后隨濃度增大轉(zhuǎn)為抑制作用。此外，10 mmol/L Al3+可分別使蠶蛹[18]和凡納濱對(duì)蝦[15]幾丁質(zhì)酶失活5.2%和14.2%，在同樣濃度下，Al3+可使中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶失活18.6%。

重金屬經(jīng)常是酶的抑制劑。Zn2+、Cu2+和Hg2+能強(qiáng)烈抑制短芽孢桿菌[21]幾丁質(zhì)酶活性；10 mmol/L Cu2+、Zn2+和Cd2+可分別使黏質(zhì)沙雷氏菌[25]幾丁質(zhì)酶失活17.4%、28%和26.7%；Zn2+和Hg2+也可分別抑制疏綿狀嗜熱絲孢菌[23]幾丁質(zhì)酶活性；10 mmol/L Hg2+和Pb2+可使宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)DG-3[27]產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶(Chi46)完全失活；而凡納濱對(duì)蝦[15]幾丁質(zhì)酶在10 mmol/L的Cd2+、Pb2+和Hg2+中可分別失活11.7%、35.0%和95.6%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度Cu2+對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)為激活效應(yīng)，后隨濃度增大轉(zhuǎn)為抑制作用，Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶抑制作用順序?yàn)镠g2+>Zn2+>Pb2+>Cd2+，10 mmol/L Hg2+可使幾丁質(zhì)酶活力喪失83.0%。

目前，金屬離子對(duì)內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶的影響機(jī)制研究報(bào)道較少，但對(duì)具有外切酶性質(zhì)的幾丁質(zhì)酶——N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響機(jī)理研究較多。有研究表明，Hg2+對(duì)凡納濱對(duì)蝦[28]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制屬于不可逆抑制，底物對(duì)Hg2+的抑制還具有保護(hù)作用，且Hg2+是通過(guò)與半胱氨酸的巰基共價(jià)結(jié)合從而導(dǎo)致酶失活的；而Zn2+對(duì)凡納濱對(duì)蝦N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制則表現(xiàn)為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，Zn2+可能是與N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白的組氨酸或半胱氨酸結(jié)合，導(dǎo)致酶蛋白構(gòu)象的變化，從而引起酶的失活[29]；但是，Zn2+對(duì)擬穴青蟹(Scyllaserrata)[14]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制則是一種可逆的混合型抑制作用；此外，Cd2+對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[30]精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)抑制作用，抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；但CuSO4對(duì)該酶的抑制則表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用[31]。

因此，不同金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶有不同的影響，同一種金屬離子對(duì)不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶效應(yīng)也不同。

3.3 有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶的影響

酶依賴其活性中心與底物結(jié)合并產(chǎn)生催化反應(yīng)，有機(jī)溶劑能滲透入酶的活性中心，降低活性中心的極性，從而增加酶與底物的靜電斥力，降低了酶與底物的結(jié)合能力。因?yàn)椴煌袡C(jī)溶劑的極性大小不同，必然對(duì)酶呈現(xiàn)不同的影響效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲醇、乙醇、異丙醇和正丙醇等4種有機(jī)溶劑對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶均呈現(xiàn)抑制作用，其抑制作用的強(qiáng)弱與4種有機(jī)溶劑的極性大小(甲醇>乙醇>異丙醇>正丙醇)呈正相關(guān)，其中甲醇極性大，對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制作用最強(qiáng)。甲醇、乙醇和正丙醇對(duì)凡納濱對(duì)蝦[13]體壁幾丁質(zhì)酶也有類似的抑制作用。

丙酮對(duì)蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質(zhì)酶活力有較強(qiáng)的激活作用，激活效果在2.5%～25%的體積分?jǐn)?shù)內(nèi)與體積分?jǐn)?shù)成正相關(guān)；而在0～50%體積分?jǐn)?shù)內(nèi)，丙酮對(duì)凡納濱對(duì)蝦[13]幾丁質(zhì)酶也呈激活作用。本試驗(yàn)中，丙酮也同樣具有促進(jìn)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶活力的作用。丙酮是非質(zhì)子極性溶劑，酶蛋白與溶劑之間直接接觸，蛋白質(zhì)分子的表面結(jié)構(gòu)有所變化，這些變化可能使幾丁質(zhì)酶活性中心的柔性增強(qiáng)，有利于酶功能的發(fā)揮。

有研究表明，低體積分?jǐn)?shù)的二氧六環(huán)和二甲亞砜對(duì)凡納濱對(duì)蝦[13]幾丁質(zhì)酶有激活作用，且隨體積分?jǐn)?shù)升高激活作用減弱并逐漸轉(zhuǎn)為抑制作用，與本試驗(yàn)中二氧六環(huán)和二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟幾丁質(zhì)酶的影響效應(yīng)相似。二甲亞砜對(duì)蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質(zhì)酶也表現(xiàn)為先激活后抑制的效應(yīng)；但是，二氧六環(huán)在體積分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)，對(duì)蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質(zhì)酶的影響不明顯，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于5%時(shí)，對(duì)酶開始呈現(xiàn)激活作用。