PCR技術在水產動物疾病檢測中的應用

李偉哲，劉 露，張 輝，肖 勤

( 1.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001； 2.河北農業大學 海洋學院，河北 秦皇島 066003 )

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術[1]。1985年，美國學者Mulis等首創了PCR技術，并由美國PE-Cetus公司進一步開發研制[2]。PCR技術的最大特點為可將微量的基因片段短時間內進行指數擴增，并具有較高的靈敏度和特異性，可對目的基因進行快速檢測，因此，其應用領域不斷擴大。目前，PCR技術已廣泛地應用于醫學檢測[3]、環境監測[4]、轉基因食品[5]、水產養殖[6]等多個領域。隨著PCR技術的發展，以常規PCR技術為基礎，根據需求不同，又衍生出多種新型PCR技術，如多重PCR[7]、實時熒光定量PCR[8]、巢式PCR等[9]。這些技術在病原菌快速檢測方面，特別是在多種病原菌的同時檢測、分型鑒定，以及定量檢測方面均優于其他技術。各類PCR技術已廣泛應用于動物臨床疾病診斷，為其在水產動物疾病檢測中的應用提供了相應的技術基礎。

隨著我國水產養殖業的規模持續擴大[10]，集約化程度不斷提高，我國水產養殖動物病害頻繁暴發，其致病微生物在水產養殖中已達200種以上[11]。常規的水產動物疾病檢測手段在其靈敏度方面還有欠缺，難以用于對微量致病微生物的快速檢測。近年來，國內外很多學者對PCR技術在水產動物致病微生物檢測及實際生產中的應用進行了大量的研究[12]。筆者基于此，對各類PCR技術在水產動物檢測中的應用進行了綜述，并對新型PCR技術在該方面的發展趨勢進行了展望。

1 常規PCR

常規PCR是根據目的核苷酸序列設計引物，擴增其特異性片段，并進行電泳分析[13]。目前，PCR技術已應用于多種細菌的診斷及樣品檢測。2001年Altinok等[14]以魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)的16S rRNA保守序列設計引物，應用PCR技術，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血樣中成功檢測出了該細菌，實現了對鮭科魚類紅嘴病的快速檢測。2009年，文萬僥等[15]建立了基于PCR技術的河流弧菌(Vibrioftuvialis)快速檢測體系，特異性良好，其靈敏度可達9.3×103cfu/mL。隨后，姚東瑞等[16]建立了一種哈維氏弧菌(V.harveyi)的PCR檢測體系，該體系可用于快速診斷由此細菌所引起的水產動物疾病。蔣依依等[17]根據諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)的16S～23S轉錄間隔區(Intergenic spacers, ITS)序列設計特異性引物，建立了諾卡氏菌的PCR快速檢測體系，具有較好的特異性。同時該 PCR 體系也具有較高的靈敏度，對 DNA 模板的檢出限可達5 pg/μL，該方法比傳統細菌鑒定更為靈敏、高效。黃冠軍等[18]基于柱狀黃桿菌(Flabobacteriumcolumnare)保守性毒力基因即硫酸軟骨素裂解酶基因的一段保守序列，建立了柱狀黃桿菌的常規PCR檢測體系，具有較好的檢測特異性，對靶標 DNA的檢測靈敏度為pg級，對柱狀黃桿菌的檢測靈敏度為1.25×103cfu/mL。

除細菌外，PCR技術對病毒的檢測也在水產動物疾病防治中得到了應用。例如孫新穎等[19]將不同地區得到的白斑綜合征病毒核酸樣本通過設計特定引物，對ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94以及ORF125片段進行PCR擴增，通過測序來分析不同樣本的缺失及變異差異。結果顯示，白斑綜合征病毒在中國不同地區存在一定程度的變異, 其在序列中的缺失、重復單元數目以及單核苷酸多態性的差異較為明顯。隨后Simrouni等[20]利用PCR技術對不同地區的白斑綜合征病毒的ORF94序列進行了分析對比，證實在8個不同國家白斑綜合征病毒的該片段都存在一定程度的變異，且白斑綜合征病毒的變異存在不同來源，主要為飼料和仔蝦。把握好這兩點因素可避免對蝦產業造成重大經濟損失。常規的PCR技術操作簡單，可特異性的快速檢測細菌和病毒，但為滿足多層次、快速、精準的檢測需求，又衍生出多種新型PCR技術[21]。

2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應體系中，加入多對不同特異性引物，同時擴增出多個目的基因片段的PCR技術，其優點是可同時對多種病原微生物進行檢測或鑒定。

在病毒檢測方面，Tsai等[26]建立了可同時檢測白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的多重PCR檢測體系。以3個引物組，按3∶1∶1的比例混合擴增桃拉綜合征病毒，白斑綜合征病毒和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)基因組。結果表明，在沒有病毒感染的情況下，僅有一條片段進行了擴增；在被白斑綜合征病毒或桃拉綜合征病毒感染的樣本中，出現了兩條擴增片段；在同時感染兩種病毒的情況下，所有3種擴增片段可同時被檢測到，該結果對白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的同時檢測有一定指導意義。2014年劉飛等[27]針對6種對蝦病毒，包括白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、肝胰腺細小病毒、桃拉綜合征病毒、對蝦桿狀病毒和傳染性肌肉壞死病毒分別設計引物，成功進行了多重PCR檢測。

在病毒的分型檢測方面，多重PCR是首選技術之一。曾偉偉等[28]針對草魚呼腸孤病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型毒株的保守區域分別設計3對引物，建立了草魚呼腸孤病毒三重反轉錄PCR(RT-PCR)體系。該方法對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型草魚呼腸孤病毒的檢測限分別為260、190、230 拷貝的病毒量。該方法可特異性的檢測各種類型的草魚呼腸孤病毒, 且具有較高的敏感性。

以上研究充分證明，多重PCR技術具有較常規PCR省時、簡便且試劑消耗少等優點，在實際檢測中具有一定的應用價值。但在檢測過程中也存在著不足，若有極少量外源性DNA污染，就可能會出現假陽性結果。另外，多對引物同時擴增時，若試驗條件控制不當，很容易導致進行非特異性擴增。

3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR (FQ-PCR)是通過監測PCR 反應過程中所加入熒光基團的熒光信號，利用已知含量的標準品繪制標準曲線，對未知樣品進行定量分析的一種核酸定量技術。近幾年來，實時熒光定量PCR技術受到了廣泛關注[29-31]。該方法可實時監控整個PCR過程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，很好的解決了PCR只能定性而不能定量的問題。實時熒光定量PCR包括探針型和非探針型兩類。

探針型是在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團的一段，并與靶序列形成互補的寡核苷酸序列，通過探針的熒光強度指示擴增量，實現了熒光信號的累積與PCR產物同步。實時熒光定量PCR工作原理見圖1[29]。隨著各種新探針技術的不斷涌現，韋信賢等[32]總結了目前常用的實時熒光定量PCR探針(表1)。

圖1 TaqMan熒光探針工作原理[29]

非探針型則通常利用染料來指示擴增量，特異性較探針型稍低，但試驗操作簡潔方便。非探針型工作原理見圖2[29]，雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ可以結合到雙鏈DNA上面，隨著PCR過程的進行，結合的雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ染料分子逐漸增多，所檢測到的熒光信號亦相應增強，從而實現實時定量檢測。

圖2 雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ工作原理[29]

表1 目前熒光定量PCR常用探針比較[32]

注：“+”代表程度的強弱或難易.

目前，實時熒光定量PCR技術已成功應用于水產病毒的檢測。Liu等[33]建立了傳染性肌肉壞死病毒的實時熒光定量PCR反應體系，該方法可檢測到傳染性肌肉壞死病毒質粒cDNA可低至1拷貝/μL，且不與其他病毒產生交叉反應，具有很好的靈敏度和特異性。Liu等[34]根據蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)的SSU rDNA序列設計了一對特異性引物，建立了蝦肝腸胞蟲的實時熒光定量PCR反應體系，其靈敏度可達8.3×101拷貝/μL，較傳統PCR方法，該法還有可快速檢測大批量樣本的優點。Kumar等[35]建立了一種檢測靈敏度低至12 拷貝/μL的斑節對蝦桿狀病毒實時熒光定量PCR反應體系，該體系可以有效地用于斑節對蝦桿狀病毒的定量檢測，且與傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑綜合征病毒和肝胰腺細小病毒無交叉反應。該方法還可通過對蝦排泄物的檢測來判斷親體中低水平的斑節對蝦桿狀病毒感染狀況，可見其靈敏度之高。劉寶彬等[36]采用實時熒光定量PCR技術對天津大港地區采集的108尾凡納濱對蝦進行檢測。結果表明，傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性檢出率100%，每微克對蝦組織DNA 的病毒拷貝數為103～107；蝦肝腸胞蟲陽性檢出率為49.1%，每微克對蝦組織DNA的拷貝數為103～105。最終通過對病毒載量指數相關性分析證實，該批蝦患病為傳染性皮下及造血組織壞死病毒和蝦肝腸胞蟲的混合感染所致，充分體現了該方法可實時監測并對大量樣品準確定量的優點。

在實時熒光定量PCR與其他檢測方法的對比中，Poulos等[37]利用原位雜交、免疫組織化學、常規反轉錄PCR和實時熒光定量PCR 4種方法檢測桃拉綜合征病毒時指出，實時熒光定量PCR是檢測桃拉綜合征病毒晚期慢性感染疾病的最佳選擇。Pooljun等[38]建立了一種檢測蝦偷死野田村病毒的實時熒光定量PCR檢測體系。結果表明，實時熒光定量PCR檢測靈敏度可達1 拷貝/μL，而常規PCR與巢式PCR最低檢測限分別為10 000拷貝/μL和100拷貝/μL，與常規PCR及巢式 PCR相比，實時熒光定量PCR靈敏度顯然更高。Jin等[39]對平板計數法和實時熒光定量PCR兩種定量檢測方法進行了評價，其中實時熒光定量PCR對蝦副溶血弧菌的靈敏度約為58 cfu/mL，與標準平板計數方法相比，實時熒光定量PCR的定量結果顯示出良好的統計學相關性(r2=0.96)。付小哲等[40]針對傳染性脾腎壞死病毒的開放讀碼框ORF007基因設計特異性引物，建立了實時熒光定量PCR體系。結果表明，實時熒光定量PCR測定的病毒拷貝數與細胞病變效應法測定的病毒滴度具有良好的線性關系，實時熒光定量PCR法可替代細胞病變效應(CPE)法應用于定量測定傳染性脾腎壞死病毒疫苗抗原含量，大大縮短了疫苗制備的時間。這些充分說明了該法的優越性。目前，實時熒光定量PCR特異性良好、靈敏度較高、速度快，但試驗成本較高，需要特殊的熱循環儀和試劑，操作過程較為復雜，從而限制了其廣泛的應用。

4 巢式PCR

巢式PCR(Nested PCR)是同時使用兩對PCR引物擴增目的片段，第一對引物和普通PCR相似，第二對引物位于第一次PCR擴增片段的內部。其優點在于第二輪PCR產物幾乎或完全沒有因引物特異性弱而造成非特異性擴增，特異性非常高。

目前，巢式 PCR也已廣泛應用于水產動物疾病的檢測，李晨等[41]以急性病毒性壞死病毒全基因組序列中的保守區段設計引物，建立了巢式 PCR檢測體系，成功檢測出櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中的急性病毒性壞死病毒。高文輝等[42]在牡蠣皰疹病毒3個變異株全基因組序列比對的基礎上，篩選出牡蠣皰疹病毒基因組中高度保守的DNA聚合酶基因片段，建立了巢式PCR檢測體系。結果表明，該方法能穩定地檢出100 拷貝/μL的病毒DNA，且不與其他海水養殖動物常見的病原發生交叉反應，具有較高特異性，適用于牡蠣皰疹病毒不同變異株的檢測。王紫燕等[43]分別以巢式 PCR和常規PCR來檢測白紋伊蚊(Aedesalbopictus)幼蟲體內的白斑綜合征病毒，結果表明，相比于常規PCR，巢式 PCR的靈敏度與擴增效率更高。另外，Kim等[44]依據pGEM-T載體中的氨芐西林抗性基因設計引物，建立了鯉春病毒的巢式 PCR檢測體系。結果表明，與常規PCR相比，巢式 PCR可降低假陽性現象，提高鯉春病毒檢測準確性，但在實際應用中該技術仍存在重復性較差、條件要求較高等不足之處。

5 反轉錄PCR

反轉錄PCR(RT-PCR)又稱為逆轉錄PCR，其原理是以RNA為模板，通過反轉錄酶將RNA轉錄為cDNA，再對cDNA進行擴增，從而檢測目的基因。在水產養殖中，存在大量由RNA病毒感染的疾病。張奇亞[45]總結了水產動物病毒中RNA病毒的種類(表2)。

表2 水生動物RNA病毒屬及形態結構特征[45]

注：“+”代表有囊膜，“-”代表無囊膜.

反轉錄PCR技術是檢測RNA病毒的主要方法。Xie等[46]建立了多重反轉錄PCR體系，同時從蝦中檢測出桃拉綜合征病毒、白斑綜合征病毒和傳染性皮下及造血組織壞死病毒3種病毒。說明該方法同樣適用于多種RNA病毒的同時檢測。2014年Yuasa等[47]成功檢測出位于復制階段的錦鯉皰疹病毒。隨后Shimahara等[48]以鯉春病毒的G蛋白基因設計引物，建立了反轉錄PCR檢測體系。其檢測極限為7.1×102拷貝/μL，且該方法不僅適用于檢測病毒懸浮液中所提取的RNA，同樣可鑒別存在于魚組織中的RNA。2018年Hwang等[49]基于病毒性出血性敗血癥病毒核衣殼基因序列設計引物，建立了病毒性出血性敗血病病毒4種基因型的反轉錄PCR檢測體系。并應用于來自韓國褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的病毒性出血性敗血病病毒的鑒定。另外，基于反轉錄PCR技術，Kim等[50]設計了5對針對病毒性出血性敗血病病毒核蛋白(N)基因的引物，建立了一種新型循環反轉錄PCR(cRT-PCR)體系，其靈敏度優于細胞培養法、實時熒光定量RT-PCR法的檢測。以上說明RT-PCR技術已開始廣泛應用于水產動物RNA病毒的檢測中。

但在實際應用中RNA容易降解，易導致擴增失敗或產生非特異性產物。此外，RNA提取過程以及反轉錄過程中也容易導致假陰性的結果出現。針對這一問題，Kiatpathomchai等[51]以黃頭病毒的開放閱讀框架3序列(編碼gp64蛋白)設計了兩對引物，以蝦的血淋巴為樣本，溶于10%的檸檬酸鈉混合進行反轉錄PCR檢測，有效減少了因RNA降解所產生的影響。

6 數字PCR

數字PCR(dPCR)也稱單分子PCR，是近年來核酸定量的新方法，其中微滴數字PCR(ddPCR)最為常見。其檢測過程主要包括PCR擴增和熒光信號分析兩部分(圖3)[52]。在PCR反應前，將樣品分散至幾萬個單元反應室中，使每個單元中只存在單個DNA分子。在熒光信號分析階段，采用終端檢測，對每個反應單元的熒光信號進行采集，然后計數得到樣品的原始濃度。與實時熒光定量PCR不同的是，整個數字PCR過程不需要設計標準曲線，且具有更高的特異性和重現性，可以實現真正意義上的絕對定量。

圖3 數字PCR原理[52]

Jia等[53]比較了反轉錄數字PCR(RT-ddPCR)與逆轉錄定量PCR(RT-qPCR)兩種方法對13個不同區域的傳染性造血器官壞死病毒毒株的測定。結果表明，反轉錄數字PCR雖然檢測靈敏度與檢測范圍弱于反轉錄定量PCR，但其相關性可達到69.4%～100%。郝中香等[54]以ORF6基因設計鯉皰疹病毒Ⅱ型引物，建立了數字PCR檢測體系。結果顯示，數字PCR的檢測靈敏度較熒光定量PCR高5倍，且重復性較高，適合于鯉皰疹病毒Ⅱ型的快速檢測和病原流行病學調查。趙欣等[55]對鯉皰疹病毒Ⅱ型的進一步研究顯示，數字PCR及熒光定量PCR兩種方法線性關系和特異性均良好。但與熒光定量PCR相比，數字PCR具有更高的重復性，且在臨床樣品檢測中，數字PCR技術的陽性檢出率為76.67%，熒光定量PCR技術的陽性檢出率為73.33%，表明數字PCR技術在鯉皰疹病毒Ⅱ型實際檢測中具有一定的優勢。

這些試驗數據充分證明數字PCR能實現靈敏、準確的絕對定量，且數字PCR能夠有效避免常規PCR抑制劑苯酚、氯化鈉、鐵離子等的影響[56]。但其耗材成本高、試驗通量少，不能實現操作智能化，儀器定價高，成為該技術推廣使用的一大難題。

7 PCR與其他技術的聯用

PCR不僅可以單獨用來檢測病原體, 也可與其他技術相結合從而充分發揮其優點。Di等[57]將PCR與ELISA聯用對貝類中副溶血弧菌進行了檢測。其主要利用ELISA方法代替電泳檢測PCR擴增產物，與電泳相比，PCR-ELISA的檢測靈敏度提高了100倍。張蕾等[58]將PCR與納米免疫磁分離技術(Nano-IMB)結合，建立了一種針對副溶血弧菌的反轉錄PCR快速檢測方法。納米免疫磁珠在菌體濃度為103cfu/mL時，對副溶血弧菌的捕獲率達到74%，將納米免疫磁珠與反轉錄PCR技術相結合，檢測副溶血弧菌的靈敏度可達140 cfu/mL，在食品基質添加試驗中，其檢測限為2 cfu/25 g樣品，該技術具有很好的應用價值和應用前景。尹偉力等[59]建立了一種可同時檢測桃拉綜合征病毒、黃頭病毒的液相芯片技術。該方法以桃拉綜合征病毒的衣殼蛋白CP2基因和黃頭病毒的非結構蛋白N基因設計特異性引物并標記生物素，探針氨基化修飾，熒光編碼微球偶聯后與桃拉綜合征病毒、黃頭病毒反轉錄PCR產物雜交，并用液相芯片儀器檢測熒光信號。該方法最低檢測限可達100 pg/μL，與白斑綜合征病毒、鯉春病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒等均無交叉反應，與常規PCR 技術相比，由于液相芯片檢測體系通過激光檢測核酸雜交微球的集合體，有效避免了多種核酸擴增產物的相互干擾，提高了靈敏度。另外Xu等[60]建立了多重PCR與高效液相色譜(HPLC)聯合快速檢測方法(mPCR-HPLC)，可同時檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌(V.vulnificus)等。該方法特異性良好，靈敏度可達10 cfu/mL，可用于定量監測樣本中目標菌的動態變化。

各種技術的聯用，通過充分發揮其各自優點，實現了提高靈敏度、特異性及檢測通量的目的，形成了常規方法無法比擬的優勢。但是在實際應用上還略顯不足，因此PCR技術與其他技術的創新聯用還需進一步的開拓與發展。

8 結論與展望

PCR技術目前在水產動物疾病檢測方面，已經得到了廣泛應用，很多新型的衍生技術如多重PCR、實時熒光定量PCR、巢式PCR等也有初步應用。另外，PCR與其他技術如酶聯免疫吸附、納米磁性微球免疫分離、高效液相色譜等的聯用，也得到了進一步的發展。在實際臨床樣品檢測中，應針對不同檢測方法的特點進行合理選擇，在應用中不斷積累經驗，優化各種方法，才能使PCR技術在水產疾病檢測領域具有更廣泛的應用。隨著PCR相關技術的發展及其與其他技術的聯用，在未來的水產動物疾病檢測領域，PCR技術將向著易操作、低成本、高靈敏度、高特異性及自動化的趨勢發展，并將以其特有的優勢在水產動物疾病診斷中發揮更大的作用，推動水產養殖業健康發展。