SB203580減輕高原低氧大鼠腦水腫的實驗研究

施冰，馮振龍，趙永歧，朱玲玲，李俊峽

(1.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心心內科，北京 100700；2.軍事科學院軍事認知與腦科學研究所)

在缺氧條件下，p38MAPK可被磷酸化活化，通過磷酸化活化轉錄因子調控特定基因表達，進而將信號從細胞外傳導到細胞核，參與細胞生長、發育、分裂等細胞生物學過程。p38MAPK信號通路參與了腦水腫的信號傳導。小分子化合物SB203580是p38 MAPK通路特異性抑制劑,具有抗缺氧、減輕炎性反應等作用。前期研究中，課題組通過全轉錄組測序和生物信息學分析，預測SB203580具有潛在的防治急性高原反應的功能。本研究運用綜合實驗艙模擬海拔7000 m高原低氧環境，探索SB203580防治急性高原低氧大鼠腦水腫的效果及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型構建與實驗分組 選用成年健康六周齡SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號:SCXK(京)2016-0006。所有動物實驗均通過中國人民解放軍總醫院第七醫學中心倫理委員會審核。采用隨機數字表法將SD大鼠分為高原低壓低氧實驗組(HH組)、SB203580干預組(SB組)和常壓常氧對照組(con組)。每組18只動物。應用實驗艙(貴州風雷航空軍械有限責任公司)模擬高原低壓低氧條件。實驗艙參數設定：模擬海拔高度7000 m，升降速度10 m/s，艙內壓力56 kPa，艙內氧氣壓力8.6 kPa,艙內溫度22.8 ℃，艙內濕度24%RH。HH組和SB組的大鼠置于低氧實驗艙內飼養，實驗艙運行時間23 h/d。每日開倉1 h用于更換墊料、飼料和飲用水。晝夜比12 h∶12 h。Con組大鼠置于實驗艙外飼養，處理等同于實驗組大鼠。

1.2 實驗藥品及處置方法 SB203580和DMSO購自sigma公司。DMSO配置為20 mM儲備液，SB203580溶于30%DMSO中配置成溶液。SB203580溶液于每天開倉時進行腹腔注射，根據大鼠體質量計算SB203580溶液注射量(10 mg/kg)。每日注射1次，每只大鼠連續注射7 d。

1.3 腦組織含水量檢測 各組大鼠完成實驗后，腹腔麻醉注射處死。剖開顱骨，無菌條件下取出全腦，濾紙吸干。用電子天平稱量全腦濕質量后，置于120 ℃恒溫干燥箱烘干24 h 至恒質量，稱重腦組織干質量。計算腦組織含水量=(濕重-干重) /濕重×100%。

1.4 腦組織病理檢測 各組大鼠完成實驗后，腹腔麻醉注射處死。剖開顱骨，無菌條件下取出全腦，濾紙吸干。腦組織用40 mL/L多聚甲醛溶液固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，連續切5片，片厚約4 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察病理變化。

1.5 腦組織AQP1 和AQP4 mRNA檢測 應用real time PCR檢測各組大鼠腦組織AQP1和AQP4mRNA表達。選取100mg腦組織標本，采用Trizol法提取組織總RNA。通過Reverse Transcription Kit將RNA逆轉錄為cDNA,使用熒光定量PCR試劑盒對AQP1和AQP4mRNA進行測定。檢測總體系為25 μL(其中上下游引物各0.5 μL、Premix 12.5 μL,cDNA模板2 μL、ddH2O 9.5 μL)。PCR程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，共40個循環。各組實驗獨立重復3次。實驗數據使用AQP4和β-actin循環閾值(CT)之差(ΔCt)計算得到相關基因的表達情況,計算對比的樣本間基因表達的差異(ΔΔCt)。以β-actin作為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量,以對照組的RQ值為1,各組是相對于1的變化倍數。引物由上海生工合成。各基因擴增的上下游引物序列見表1。

表1 各基因擴增的上下游引物序列

2 結果

2.1 大鼠腦組織含水量測定結果 與對照組[(70.15±3.32)%,n=6]比較，HH組大鼠腦組織含水量[(77.83±0.30)%,n=6]顯著升高(P<0.05),而SB組大鼠腦組織含水量[(76.66±0.32)%,n=6]差異無統計學意義(P>0.05)。與HH組比較，SB組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。提示SB203580可減輕高原低氧大鼠腦水腫。

2.2 腦組織AQP1和AQP4mRNA檢測結果 與對照組比較，HH組大鼠腦組織AQP1mRNA表達量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠腦組織AQP1mRNA表達量未見顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織AQP1mRNA表達量顯著降低(P<0.01)(表2)。提示SB203580可下調高原低氧大鼠腦組織AQP1mRNA表達。

與對照組比較，HH組大鼠腦組織AQP4mRNA表達量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠腦組織AQP4mRNA表達量未見顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織AQP4mRNA表達量顯著降低(P<0.01)(表2)。提示SB203580可下調高原低氧大鼠腦組織AQP4mRNA表達。

2.3 大鼠腦組織病理變化 腦組織HE染色病理切片提示，對照組大鼠腦組織結構完整，神經元細胞排列整齊。低氧組大鼠腦組織神經元排列紊亂，細胞減少，血管擴張。血管、神經細胞周圍間歇增大。與低氧組比較，SB203580組大鼠腦組織損傷程度較輕(圖1)。

3 討論

當機體暴露于高原低壓低氧條件下時，腦和心臟作為需氧量較大的組織器官，對環境中氧分壓的改變十分敏感，故而造成的損傷也較為明顯[1-2]。腦損傷后炎性物質與氧化自由基等物質在腦組織的繼發性損傷中起著重要的作用。腦水腫是腦缺氧后腦組織繼發性損傷的主要表現之一。雖然許多學者對腦水腫的產生機制此作了大量實驗和臨床研究，但其具體的病理生物學機制尚未完全闡明。水通道蛋白(AQP) 是一類廣泛分布于機體不同組織器官中的特異性跨膜轉運水的膜蛋白，共有13個亞型。可以促進水分子的快速跨膜轉運,維持細胞內外滲透壓力的平衡。在神經系統表達的水通道蛋白有AQP1、3、4、5、8、9等6個亞型。其中AQP1、AQP4在腦組織表達較多,在腦外傷、腦出血、腦腫瘤等中樞神經系統病變時表達增加,參與腦水腫形成。

AQP1主要集中表達于側腦室、第四腦室及第三腦室的脈絡叢上,參與腦脊液的生成和調節,并參與水和離子的平衡[3]。AQP4 是中樞神經系統的主要水通道蛋白，在腦組織水平衡的調節中起著關鍵作用[4]。AQP4在正常腦組織中呈極性分布,主要位于血管周圍的星形細胞足突處,靠近神經元側足突表達較少。這種分布模式有助于調節細胞與血管間水的轉運。AQP4的高表達與細胞毒性腦水腫程度呈正相關[5]。腦缺氧時，AQP4在血管側分布減少,而在神經元側分布增加,這種極性改變導致過多的水分子滯留在星形膠質細胞內造成細胞腫脹，導致腦水腫發生。因此，調節星形膠質細胞AQP4的表達可減輕腦水腫程度[6-7]。適時、正確地干預AQP4的表達變化可能為有效控制腦水腫的發生發展提供新思路。

SB203580是一種常用p38MAPK抑制劑，可以通透細胞，抑制p38MAPK激活，進而有效抑制一些炎性因子(如IL-1β、TNF-α)介導的部分信號傳導。SB203580作為一種新型生物制劑，目前已被廣泛應用于多種疾病治療的研究領域。本研究發現，與常壓常氧對照組相比，低壓低氧組大鼠腦組織中AQP1及AQP4mRNA表達增高且伴腦組織含水量增加。提示在高原低氧環境下，大鼠腦組織缺氧后P38信號通路被激活，致使AQP1和AQP4高表達，進而增加腦含水量。以往研究發現，阻斷p38的激活可以降低星形膠質細胞氧糖剝奪/復氧模型中AQP1及AQP4mRNA表達[8]，減輕大鼠腦創傷后腦水腫程度。本研究發現，與低氧組相比，SB203580組大鼠腦組織AQP1和AQP4mRNA的表達顯著降低伴腦含水量減少。提示SB203580可靶向抑制AQP1和AQP4的激活，導致AQP1和AQP4表達下調，進而減少腦含水量，具有抗高原低氧腦水腫的效果。本實驗研究為急性高原病的預防和治療提供了新的干預策略和干預靶點。

表2 SB203580對大鼠腦組織AQP1mRNA和AQP4mRNA表達的影響

注：與對照組比較，aP<0.01;與HH組比較，bP<0.01

圖1 SB203580對高原低氧腦組織病理學改變的影響 (HE染色) 。A：對照組，B：HH組，C：SB203580組