釀酒小曲中功能微生物的研究進展

王春曉，唐佳代，吳鑫穎，周鴻翔，邱樹毅*

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

酒曲是以糧食為原料制成的糖化發酵劑，酒曲中微生物資源豐富，為發酵食品生產所需的酶提供穩定的來源。傳統酒曲多采用自然接種和開放式培養的方式，品質不易控制且存在食品安全隱患。將功能微生物應用于釀酒與食品生產[1]，是相對于傳統工業生產更安全、高效和環保的技術方法。因此，酒曲中功能微生物的篩選和應用成為了科學研究和工業生產共同關注的焦點。小曲是我國四大酒曲之一[2]，其應用廣泛，但目前對于小曲及其中功能微生物的研究報道較少。本文著重對釀酒小曲中的功能微生物篩選、應用的研究進展進行綜述，以期為功能微生物科學研究和工業化應用提供參考。

1 釀酒小曲簡介

1.1 釀酒小曲的定義和分類

釀酒小曲多以大米、米糠、麩皮和谷類為原材料，部分加有中草藥[3]，是經人工接種曲母或根霉、酵母菌培養而成的微生物制劑[4]，因曲塊體積小而得名。小曲被稱為白藥、酒餅、白曲、酒藥、藥曲、酒曲丸等。小曲主要用于生產甜米酒、黃酒、米香型白酒、清香型白酒和豉香型白酒[5]，具有很多不同種類（表1）：根據最終發酵成酒的類型，小曲可以分為白酒小曲、甜酒曲和黃酒小曲；根據不同的生產地區，小曲可分為廣東和廣西生產米香型白酒的小曲、貴州生產固態法白酒的藥小曲、江蘇和浙江生產黃酒及甜酒的酒藥等[3]。此外，根據成品曲形態、原料和中草藥添加等的不同，小曲還可分為其他不同類別（表1）。韓國的Nuruk和日本的Koji是類似于小曲的發酵劑，其中Nuruk是以未蒸煮大米、大麥、玉米和大豆等谷物為原料，接種霉菌、酵母和細菌制成的米酒發酵劑[6]，而Koji是將純種微生物接種于蒸熟的大米或大豆中制得的發酵劑[7]。

表1 釀酒小曲的分類Table 1 Categories of Xiaoqu

1.2 釀酒小曲的來源和發展歷史

古代酒曲的發展歷史時間軸如圖1所示。周代的《尚書·說命下》中記載到“若作酒醴，爾惟曲蘗”，當時用于釀酒的酒曲均為散曲；《楚辭》中有記載春秋戰國時期“吳醴白蘗，再宿為醴”，其中的白蘗意為白米之曲，以稻米為原材料的小曲此時初步形成[8]；漢代人們先制散曲，在散曲基礎上制成塊狀曲[2]；北魏時期的《齊民要術》總結了9 種酒曲的制作工藝，尤其是利用“曲范”模具將曲塊加工成型，改進了原來手工捏制成型的工藝。此外，北魏時期人們開始制作藥小曲；藥小曲制曲工藝在晉代發展成熟，人們將草藥汁加入由大米搗碎而成米粉中，制成卵狀放置于蓬蒿中一個月成曲；唐代為節省曲房空間，將散放酒曲改進為堆放，稱為堆曲，并沿用至今；發展到宋朝時酒曲制作工藝已經完善，人工接種技術開始應用，而中草藥廣泛用于制作酒曲；到了元、明、清時期，更多的中草藥被應用在小曲的制作中，使藥小曲的制作工藝得到了進一步的發展[2]。

圖1 釀酒小曲發展時間軸Fig. 1 Developmental timeline of Xiaoqu

1.3 釀酒小曲的現代制作與應用方式

相對于傳統工藝，釀酒小曲的現代制作工藝主要發展了麩皮制曲、純種制曲、加酶小曲和機械化制曲等方式，在提高糖化力和出酒率的同時降低了酒曲的使用量，節約了原料和人工成本，酒質也得到了提高[9]。釀酒小曲發展到現在，與功能微生物的應用是分不開的。一方面，功能微生物被制作成釀酒強化曲應用于工業生產，強化曲是將原料浸泡或翻炒后粉碎過篩，接種功能性微生物或純種曲后加水拌勻并加工成型，經培養干燥制成的微生物制劑；另一方面可直接在釀酒過程中加入功能微生物。然而，現代釀酒小曲中引入最多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，對起酒化和酯化作用的功能酵母主要采用活性干酵母的形式引入，對影響風味的功能細菌則少有引入，在小曲進一步的發展中，尚需要對功能微生物的開發、工藝上合理應用及制曲機械自動化等方面開展更多深入的研究[9]。

在功能微生物的現代應用過程中，人們發現單一微生物曲釀造的產品質量穩定，但是風味復雜性及特性不明顯，于是研究者開始探索多種功能微生物協同發酵的模式，如印度毛霉與米根霉協同發酵米酒[10]、純種根霉曲與釀酒酵母按一定比例制作的強化甜酒曲[11]、黑曲霉與米曲霉混合制曲[12]、純種釀酒酵母與傳統小曲協同糖化發酵[13]等。添加中草藥是制作釀酒小曲的一種傳統方法，近年來有研究者將功能微生物引入藥小曲，分析中草藥與功能微生物之間的相互影響（表2）。據報道，中草藥成分具有改善微生物營養、抑制雜菌、抗氧化等功能[14]。微生物代謝產生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶類能夠破壞中草藥的細胞結構，將其降解為微生物可利用的糖和氨基酸等小分子物質[15]。研究表明，中草藥對酵母的生長促進作用較大，其次是黑曲霉和黃曲霉，對根霉起作用的中草藥材較少，而對細菌則主要起抑制作用[16]。

表2 中草藥對釀酒小曲及功能微生物的作用Table 2 Effect of Chinese herbal medicine on Xiaoqu and functional microbes in it

2 功能微生物的研究現狀

研究表明酒曲中的微生物主要為酵母菌、霉菌、細菌三大類[23]，通過糖化、酒化、產酯等作用影響成品酒的風味特性。通常將具有高糖化率、高產酯類、低產高級醇、高產蛋白酶等能力的微生物稱為高活性菌株，即功能微生物。釀酒小曲中功能酵母菌主要有酒化、分泌芳香物質的作用；功能霉菌主要有分解淀粉等物質的作用；功能細菌主要有產生酸類物質協調酒體的作用。研究者根據菌株的發酵性能，篩選出功能菌株應用于發酵，使酒具有所需要的風格。目前，釀酒小曲中功能微生物的認識主要通過傳統可培養方法分離獲取，近年來隨著組學技術的廣泛應用，高通量測序技術被應用于小曲中微生物的多樣性研究，結果發現了更豐富和復雜的微生物組成[24-25]，為更多功能微生物的工業應用提供了參考。

2.1 功能酵母的研究進展

釀酒小曲中的優勢酵母菌為扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜酵母（Hansenulasp.）等[26]。酵母在發酵過程中會進行生長和存活所必需的初級代謝，主要代謝產物為乙醇、乙醛和乙酸等，次級代謝并非生長必需，主要產生高級醇、酯類、硫醇和萜烯類化合物等[27-28]。

酵母菌的酒化能力直接影響酒質和發酵效率，因此是功能酵母篩選的主要關注點之一。高產酒酵母多采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培養基鑒別法來篩選[29]，該方法通過肉眼觀察菌落顏色深淺可初步判斷其酒化能力，但不利于不同研究報道之間的對比性評價。研究者還可采用酒精計法或氣相色譜法等檢測乙醇含量，定量化的研究結果有利于所篩選高產酒酵母的功能評價和工業化應用。目前已報道的高產酒酵母如表3所示（未檢測乙醇產量的研究不在其列），釀酒酵母作為主要酒化酵母，具有較強的乙醇產生能力，在發酵過程中主要通過糖酵解途徑和乙醛途徑產生乙醇（圖2）。伍保龍等[30]從米酒酒曲中篩選到一株產酒能力強的釀酒酵母5-1Y，可將230 g/L葡萄糖溶液幾乎完全發酵（糖利用率高達99.9%）產生13.16%酒精度（乙醇體積分數）。

酵母菌的產香能力對不同酒的風味特征形成起關鍵作用，作為不可忽視的風味物質，高級醇和酯類的產生主要由酵母生長不必需的次級代謝產生，其代謝途徑如圖2所示。

2.1.1 高級醇產生途徑

圖2 發酵過程中釀酒酵母產生乙醇、高級醇和酯類的代謝途徑[28,31]Fig. 2 Metabolic pathways of ethanol, higher alcohols and esters in S. cerevisiae during fermentation[28,31]

酵母在發酵過程可通過2 種途徑產生高級醇——氨基酸分解代謝途徑即Ehrlich途徑[31]（圖2中紅色箭頭）和糖代謝合成途徑（圖2中藍色箭頭）。Ehrlich途徑是發酵原料中的7 種不同氨基酸（圖2）在轉氨酶的催化下通過轉氨作用合成相應的α-酮酸，α-酮酸脫羧形成醛，醛在脫氫酶的作用下進一步還原為相應高級醇。參與Ehrlich途徑的酶主要包含氨基酸滲透酶（參與從原料中攝取亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）[32-33]、氨基酸轉移酶（在線粒體和溶膠上起到催化氨基從氨基酸轉移至α-酮酸的作用）[34]、脫羧酶（將α-酮酸脫羧形成相應的醛）和乙醇脫氫酶（將相應的醛還原為高級醇）[35-36]。研究證實，氨基酸通過Ehrlich途徑產生高級醇的每一步反應都存在各種同工酶，主要是由于環境和營養條件的不同引起的，因此給相關酶身份和編碼基因的鑒定提出了難題。如圖2所示，多個基因參與Ehrlich途徑相關酶的編碼，但人們對這些基因所編碼酶的認知尚不完全[31,37]。在氨基酸缺乏的情況下，Ehrlich途徑無法進行，此時酵母可通過糖代謝合成途徑產生高級醇：發酵原料中的葡萄糖通過糖酵解分解為丙酮酸，再進一步合成α-酮酸，或通過中間產物直接合成α-酮酸，α-酮酸經過與Ehrlich途徑相同的脫羧和還原反應形成高級醇。

高級醇或稱雜醇油是指碳原子數超過2的一元醇，主要包括正丙醇、異戊醇、異丁醇、活性戊醇、苯乙醇、酪醇、色醇和甲硫醇等[31,38]。高級醇是酒中重要的風味物質（如低濃度的苯乙醇呈花香風味[28]），但其含量過多會對神經系統造成傷害[39]，高級醇中己醇被列在有害物質數據庫中[40]，異戊醇和異丁醇對人體毒性最大，酒精飲料中高級醇總量應小于10 g/L[38,41-42]。研究者們主要通過單倍體制備、菌種誘變、從自然界分離篩選等方式獲取低產高級醇酵母，截至目前獲取的低產高級醇酵母全部為釀酒酵母（表3）。郝欣等[43]篩選了一株高級醇產量為340.906 mg/L的釀酒酵母AY-15，并進一步通過分子育種獲得高級醇產量更低的單倍體α-22（比親本AY-15低12.46%）。王國正等[44]對篩選出的低產高級醇釀酒酵母菌株CF4進行常溫常壓等離子體誘變，獲得了使正丙醇、異丁醇和異戊醇含量分別降低20%、19.4%和21.5%的誘變菌株釀酒酵母ARTP5。值得注意的是，使用不同的培養基會影響風味物質的形成[45-46]，因此表3列出的功能酵母相互之間的高級醇產量不具有可比性。

2.1.2 酯類產生途徑

高級醇和乙醇是乙酸酯類化合物的前體物質[47]，原料中的氨基酸/葡萄糖經過Ehrlich途徑/糖代謝合成途徑產生高級醇；葡萄糖經過糖酵解途徑和乙醛途徑產生乙醇。作為前體物質，高級醇或乙醇都可進一步與乙酰輔酶A通過合成反應產生乙酸酯類化合物，前者生成乙酸高級酯（如乙酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸苯乙酯等）而后者生成乙酸乙酯[28]。如圖2所示，該反應由ATF1和ATF2基因所編碼的乙醇乙?；D移酶催化合成[48-49]。此外，原料中的脂質通過代謝可產生中鏈脂肪酸，被輔酶A激活后可進一步與乙醇反應合成乙酯類化合物（丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等）[28]。該反應由EEB1和EHT1編碼的酰基轉移酶所催化（圖2）[50]。

發酵過程中產生的乙酸酯類化合物主要呈現香蕉、蘋果等香味特征，而乙酯類化合物呈現蘋果、草莓、梨和茴香等香味特征[28]。發酵過程中產生的乙醇在含量和活性兩方面均高于高級醇，因此乙酸乙酯是發酵過程中最常見的乙酸酯類化合物[28]，也是小曲酒的主體香成分之一[46,51]。由于酯類物質對酒體風味的重要作用，研究者對高產酯酵母十分關注，研究稱漢遜酵母屬、假絲酵母屬、產朊酵母屬和扣囊覆膜酵母等是酒中酯香的主要產生菌[52]，其中扣囊覆膜酵母還具有較強的淀粉酶活性[53]。目前通過自然分離和誘變育種，研究者獲取的高產酯功能酵母如表3所示。李銳利[54]從白酒小曲中篩選出一株異常漢遜氏酵母，并將其應用到小曲酒的生產中，使乙酸乙酯含量提高了49.8%。王鵬昊等[55]從小曲中篩選到一株產酯量達2.684 g/L的異常威克漢姆酵母，其乙酸乙酯產量為2.481 g/L。

功能酵母菌可以同時具有低產高級醇和高產酯/酒的功能特征，目前獲取的酵母菌多為釀酒酵母（表3）。王勇[29]從酒曲中分離得到了2 株高產乙酸乙酯、低產高級醇的釀酒酵母Y006和Y008，并分別制成強化曲應用在釀酒生產中，證明兩者均有降低高級醇含量和提高乙酸乙酯含量及出酒率的作用。李維等[56-57]從釀酒酵母AY15的單倍體重組菌株中篩選低產高級醇和高產酯/酒的單倍體，并進一步雜交形成新的二倍體菌株AY15-BAT2＋ATF1和AY15-IAH1＋ATF1，2 株重組雜交菌在發酵高粱糖化液時同時表現了低產高級醇和高產酯的功能特征。

表3篩選的功能酵母大多已在實驗室或中試條件下通過直接接種加入發酵醪的方式進行應用實驗，結果證明功能酵母可以改善酒質或酒的風味，具有一定的應用價值[9,58]。楊強等[59]將功能酵母制備成麩皮種并按一定比例加入酒曲中，有效改善了小曲白酒的風味。魏浩林等[11]將功能酵母與純種根霉曲按比例混合復配制成強化曲，提高了酒曲的發酵力和酯化力，為制作新型酒曲提供了思路。表3所示的21 株功能酵母中只有5 株分離自釀酒小曲，因此需進一步加強對釀酒小曲功能酵母的研究和工業應用。

2.2 功能霉菌的研究進展

功能霉菌在發酵過程中主要起糖化作用，即分離水解原料中的淀粉等大分子物質為葡萄糖。在厭氧條件下，一些霉菌還可進一步利用糖發酵產生乙醇（酒化作用）。除淀粉酶之外，功能霉菌還能產生蛋白酶、纖維素酶、酒化酶和單寧酶等[77]，在食品、釀造以及生物工程等產業中發揮重要作用（表3）。

表3 已篩選獲取的功能微生物種類Table 3 Categories of functional microbes that have been obtained in the literature

2.2.1 淀粉酶

霉菌產生的淀粉酶有液化淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷轉移酶等。液化淀粉酶（α-淀粉酶）主要由青霉和曲霉產生，能水解淀粉內部的α-1,4-糖苷鍵，水解產物為短鏈糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖，從而達到降低淀粉黏度（液化）的目的。糖化酶（α-1,4-葡萄糖水解酶）主要由根霉和曲霉產生，能將淀粉結構中的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵切斷，使絕大部分淀粉轉化為葡萄糖[78]，為進一步發酵提供原料。酒曲中功能霉菌主要通過自然分離和菌種誘變的方式獲取，其中高產淀粉酶菌株是目前主要的關注點（表3）。李江華等[67]從黃酒酒曲和酒藥中分離到一株米曲霉A019，所產α-淀粉酶活力達410 U/g曲。

2.2.2 蛋白酶

蛋白酶主要由青霉和曲霉產生，分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。蛋白酶將原料中的蛋白質分解為氨基酸，氨基酸可進一步被酵母代謝，形成酒中重要的風味化合物——高級醇或酯。氨基酸還能在原料蒸煮過程中與還原糖發生美拉德反應產生風味物質[79]。酸性蛋白酶通過水解蛋白質，將一些與蛋白緊密結合的淀粉釋放出來，從而為糖化發酵創造有利條件，因此高產酸性蛋白酶的功能霉菌也是目前的研究熱點之一（表3）。尹永祺[69]從黃酒酒曲中分離到一株米曲霉DYT-30，不僅高產α-淀粉酶（68.6 U/g曲）和糖化酶（1 678.0 U/g曲），而且所產酸性蛋白酶活力達839.9 U/g曲。

2.2.3 其他酶類

一株霉菌可能產生多種酶類。研究人員曾從黃酒麥曲中分離到一株黑曲霉CF7，可分泌纖維素酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶和木聚糖酶[12]。除淀粉酶和蛋白酶外，霉菌分泌的其他酶類很多也對釀酒過程有益：纖維素酶主要由青霉和曲霉產生，纖維素酶的添加可以提高出酒率、減少高級醇含量、增加酯和酸含量[80]；根霉產生的酒化酶，在發酵過程中糖化的同時進行發酵，提高淀粉利用率[78]；一些曲霉和根霉可以產生單寧酶[81]，單寧酶能夠將單寧水解為沒食子酸和葡萄糖，沒食子酸是一種具有抗氧化性的多酚，可促進酵母菌的生長，葡萄糖則被微生物所利用產生乙醇[81]；曲霉產生的酸性羧肽酶能夠分解多肽，增加酵母的營養來源[82]；毛霉、根霉和曲霉產生的脂肪酶能將油脂水解為脂肪酸和甘油，并進一步通過三羧酸循環產生醇、酸和醛類物質，成為合成酯類的前體物質[83]。

表3所示的11 株功能霉菌中有8 株分離自釀酒小曲，說明人們對起糖化作用的功能霉菌的關注度高于功能酵母，然而，目前功能霉菌的研究多集中在淀粉酶和蛋白酶，對產其他酶類的功能霉菌分離篩選和研究相對較少（表3）。釀酒小曲中分離的功能霉菌大多被制備成純種曲或進一步與其他純種霉菌曲混合制成復合酒曲，以在工業生產中提高糖化力、改善酒質[10,69]。

2.3 功能細菌的研究進展

酒曲中的酵母和霉菌在發酵初期存在一段生長延遲期，此階段細菌起著至關重要的作用：為發酵提供酸性的環境；產生蛋白酶、果膠酶、脂肪酶、糖化酶和纖維素酶等酶類；酯化、促進美拉德反應和產生吡嗪類風味物質[74]。酒曲中功能細菌的研究如表3所示，目前已報道的功能細菌以芽孢桿菌居多，芽孢桿菌產生的中性蛋白酶能夠降解原料中的大分子蛋白質，產生的酸性蛋白酶和淀粉酶可促進酒曲的糖化和液化，還可產生吡嗪類風味物質[74]。騰軍偉等[1]從江米酒酒曲中分離的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1具有分泌凝乳酶的功能，凝乳活力達431.53 SU/mL。但是，康憲[84]指出芽孢桿菌對甜酒曲中的根霉菌菌絲有明顯的抑制作用。故在利用多種微生物協同發酵制作復合酒曲時，需考慮功能細菌相對功能酵母和霉菌的接種量，及其與其他微生物共接種時是否可協同發揮不同微生物的功能。

目前關于小曲中功能細菌的研究報道較少，表3所示的9 株功能細菌中只有1 株分離自釀酒小曲，要開發釀酒小曲中的功能細菌，需對不同釀酒小曲中的細菌進行系統性研究。由于功能細菌主要功能為產酸，無法同時滿足釀酒所需的糖化和酒化功能，因此需要與功能霉菌和酵母菌協同使用。目前鮮有文獻對釀酒小曲中篩選的功能細菌進行純種發酵研究，大多在實驗室通過直接加入的方式研究功能細菌在增加風味的同時是否會抑制霉菌糖化、酵母酒化、酯化及生長，如研究發現乳酸菌在與高產酯酵母共同使用時產生相互抑制的現象[85]?？傊?，目前對釀酒小曲中功能細菌的研究有限，需進一步開展相關應用實驗，拓展功能細菌的應用價值。

3 結 語

近年來，釀酒小曲中功能微生物的研究取得了一些進展，但相對于大曲的研究仍存在一些不足：1）釀酒小曲中微生物的多樣性研究受傳統分離篩選方法的局限，目前關于小曲微生物資源的研究不夠全面。在今后的研究中，需結合微生物組學技術對釀酒小曲中豐富的微生物資源進行全面挖掘[24-25]；2）釀酒小曲中研究較多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，對分泌其他酶類的霉菌、起酒化和酯化作用的功能酵母及影響風味的功能細菌少有報道。今后需在釀酒小曲中豐富微生物資源解讀的基礎上，加強對功能微生物的深入代謝研究和開發。也需加強對所開發的功能微生物的應用研究，目前功能霉菌主要通過制成純種曲或復合強化曲的方式進行應用實驗[10,69]，功能酵母主要采用直接接種或制成復合強化曲的方式進行應用實驗[9,11,58-59]，而對于功能細菌的應用研究尚比較局限；3）釀酒小曲中不同種類功能微生物在發酵過程中的協同、拮抗和抑制作用是工業應用中不容忽視的問題，如釀酒酵母與乳酸菌共發酵產生的促進和抑制作用[85]、黑曲霉與米曲霉混合制曲對酶活力提高的協同作用[12]等，但目前關于功能微生物間相互影響機制的研究尚不多見[46]。Zhu Jing等[42]報道稱，2 株地霉屬菌株可降低成品白酒中高級醇含量并同時增加酯類含量，為功能微生物的創新性應用提供了新的思路。今后需在對功能微生物進行應用實驗的同時研究不同種類微生物的相互作用，思考合理的應用方式，使霉菌、酵母和細菌能協同發揮作用。

隨著食品生物技術的發展，越來越多的功能微生物正在改變釀酒方式，釀酒小曲中功能微生物的研究與開發具有很好的應用前景，需要得到更多的關注。高通量測序技術、基因編輯與重組技術和宏基因組等[86-88]現代分子生物學技術的應用，能夠幫助人們快速了解釀酒小曲中微生物的多樣性，促進更多功能微生物的挖掘，有利于分析與應用特定功能微生物的功能基因。未來，宏基因組學、宏轉錄組學和代謝組學等技術的綜合利用可以幫助人們了解功能微生物間的相互作用，為在發酵過程中更好地應用釀酒小曲中的功能微生物產生高品質代謝產物提供基礎。