海南產黃皮葉及樹皮揮發油成分與抗假絲酵母菌活性的相關性研究

陳錦萍，何海超，蔡航，周聰聰，馮雅雯，馬寅正，何小穩，2，*

（1.海南醫學院，海南海口571199；2.河北醫科大學，河北石家莊050017）

黃皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]是蕓香科黃皮屬植物，廣泛分布于東半球熱帶，亞熱帶地區，在我國集中于海南、廣東、廣西等省區[1]。黃皮富含揮發油類，生物堿類，香豆素類，黃酮類等多種化學成分，具有行氣止痛，消食化痰，解毒散結等功效[2]。考慮到近年來以假絲酵母菌（Candida，C.）為代表的臨床真菌感染的發病率和死亡率逐年上升[3-5]，且目前主要抗真菌藥物多數具有明顯的毒副作用，耐藥性日趨嚴重[6]，因此尋找安全有效的新型抗真菌藥物迫在眉睫，從天然產物中特別是植物揮發油中尋求抗真菌藥物成為目前研究的熱點[7-8]。已有研究[9-12]發現黃皮葉揮發油主要成分為倍半萜及其含氧衍生物，筆者未見對黃皮樹皮揮發油成分的分析報道，且黃皮的葉及樹皮均具有抗菌消炎、抗滴蟲、抗氧化等多種生物活性[13-15]，但其揮發油是否具有抗假絲酵母菌活性鮮見報道。

本研究擬采用氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結合保留指數（retention index，RI）對不同產地的黃皮葉和樹皮的揮發油進行分析與鑒定，比較其成分及含量的差異，再通過聚類分析對揮發油分類比較，并采用紙片法對其抗假絲酵母菌活性進行初步研究，旨在闡明黃皮葉及樹皮的揮發油抗假絲酵母菌活性與成分、含量的相關性，為抗真菌新藥的研究開發尋找高效、廣譜、低毒、價廉的生物資源提供理論及試驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GC/MS-QP2010 Plus 氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司；Tanon-4100 全自動數碼凝膠圖像分析系統：上海天龍科技有限公司；HC-1000YZ 高速多功能粉碎機：永康市天祺盛世工貿有限公司；AL104 電子天平：梅特勒—托利多儀器上海有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 材料

黃皮葉及樹皮：釆自海南省海口市，經海南醫學院生藥學田建平副教授鑒定為蕓香科黃皮屬植物黃皮Clausena lansium（Lour.）Skeels（產地及采集時間見表1），標本保存于海南醫學院科學實驗中心。正構烷烴混標C8～C40 500 mg/L 于正己烷：美國o2si，編號CDGG-115320-05-1；氟康唑：上海源葉生物科技有限公司；mueller hinton（MH）瓊脂培養基、胰蛋白胨：廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖：天津市福晨化學試劑廠；正己烷（色譜純，≥98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

表1 海南產黃皮葉和樹皮的樣品來源Table 1 Sources of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

1.3 菌株

質控菌株：白假絲酵母菌（C.albicans，Ca）ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌（C.parapsilosis，Cp）ATCC 22019：廣州環凱微生物科技有限公司；克柔假絲酵母菌（C.krusei，Ck）ATCC 6258：溫州市康泰生物科技有限公司；標準菌株：熱帶假絲酵母菌（C.tropical，Ct）CMCC（F）c2f、光滑假絲酵母菌（C.glabrata，Cg）CMCC（F）c6e：中國醫學微生物菌種保藏管理中心；臨床分離菌株：Ca27（耐藥株）、Ca53，經 ITS 基因序列測定確定。將菌株在改良沙保羅氏瓊脂培養基（sabouraud dextrose agar，SDA）連續移種2 次，以保證其純度和活力。

2 方法

2.1 GC-MS條件

ZB-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫采用升溫程序：初始柱溫60 ℃保持5 min，10 ℃/min 升至 120 ℃，2 ℃/min 升至 170 ℃，10 ℃/min 升至 210 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，柱流量1.0 mL/min；吹掃流量 3.0 mL/min；進樣溫度 250 ℃，進樣量 1.0 μL。EI 源，離子源溫度250 ℃；接口溫度280 ℃；溶劑延遲時間2.0 min；檢測器電壓 0.86 kv；質量掃描時間：3.00 min ～50.00 min，掃描范圍 50 m/z～500 m/z；質譜譜庫：NIST08和NIST08s。

2.2 RI值測定

取正構烷烴混標按“2.1”項下條件進樣分析，記錄各正構烷烴保留時間，采用線性升溫公式計算各組分的RI 值：RI=100n+100（tx-tn）/（tn+1-tn），其中tx，tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數處于n 和n+1 之間的正烷烴（tn＜tx＜tn+1）的流出峰的保留時間。

2.3 黃皮葉及樹皮揮發油的提取與分析

黃皮葉和樹皮陰干，粉碎，過篩，稱取適量干燥粉末，物料比 1∶8（g/mL），浸泡 1 h，采用揮發油測定器提取2.5 h～3.0 h，收集頂部揮發油，觀察黃皮葉及樹皮揮發油的顏色并計算得油率。取10 μL 揮發油溶于1.0 mL色譜純正己烷中，進樣GC-MS，NIST 譜庫檢索結合RI定性鑒定，峰面積歸一法分析含量。剩余揮發油密封于4 ℃冰箱中保存備用。

2.4 抑菌試驗

采用美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CCLS） 制定的紙片法（M44-A2）進行抑菌圈的測定，經SDA 次代培養的新鮮菌落，挑取1 mm 大小的菌落于5.0 mL 的生理鹽水中，調節菌液濁度為0.5 麥氏濁度，約1×106CFU/mL～5×106CFU/mL。調好濁度的菌懸液均勻地涂布在MH瓊脂平板上，放置3 min～5 min，不超過15 min，使用無菌鑷子放上紙片，分別加入黃皮葉，樹皮揮發油及陽性對照（2.5 mg/mL 的氟康唑溶液）各 10 μL。Ca、Ct 于35 ℃恒溫箱中培養 24 h，Cg、Ck、Cp 培養 48 h，觀察結果，測量抑菌圈直徑，每次試驗重復操作3 次，取其平均值，通過抑菌圈的大小來判斷揮發油對各種假絲酵母菌的敏感程度。結果判讀：以氟康唑（25 μg）為標準，抑菌圈直徑≥19 mm 為敏感，15 mm～18 mm 為劑量依賴性敏感，≤14 mm 為耐藥，待測揮發油的抑菌圈直徑＞20 mm 極敏感，15 mm～20 mm 為高度敏感，10 mm～14 mm 為中度敏感，＜10 mm 表示低敏感，0 為不敏感。

3 結果

3.1 黃皮葉及樹皮揮發油的提取與分析結果

按照“2.3”的方法提取得到的黃皮葉及樹皮揮發油都具有特殊性氣味，其顏色及得油率詳見表2。

表2 海南不同產地黃皮葉和樹皮揮發油的提取結果Table 2 Extraction results of the essential oils of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

結果表明6 種揮發油的顏色和得油率均存在差異，這跟其采摘的部位，采摘產地及采摘時間有關，其成分的具體差異還需進行GC-MS 分析，因此進樣GC-MS 分析揮發油的成分及含量，比較其差異，GC-MS總離子流圖見圖1，成分及含量的分析結果見表3。

圖1 海南不同產地黃皮葉和樹皮揮發油的GC-MS 總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS chromatograms of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

表3 海南不同產地黃皮葉和樹皮揮發油成分及相對含量Table 3 Chemical components identified in the essential oil of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

續表3 海南不同產地黃皮葉和樹皮揮發油成分及相對含量Continue table 3 Chemical components identified in the essential oil of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

由表3 數據可見，從黃皮葉L1～L4 揮發油中分別鑒定了56、49、52、54 種成分，分別占揮發油總量的97.86%、97.82%、96.42%、96.87%，樹皮 B1、B2 揮發油中分別鑒定了63、60 種成分，分別占總量的92.35%、92.54%。這些成分有單萜、倍半萜、醇、酯等，其中含量最高的為倍半萜，但成分和含量差異較大。L1 中主要成分是石竹烯（20.90%）、β-紅沒藥烯（17.07%）、β-倍半水芹烯（15.71 %）、黑蟻素（13.44 %）、氧化石竹烯（8.39%）；L2 的主要成分為檀香醇（27.47%）、氧化石竹烯（9.91%）、石竹烯（9.21%）、順式-α-檀香醇（7.81 %）；L3 的主要成分有檀香醇（29.10%）、氧化石竹烯（10.90%）、石竹烯（8.74%）、β-紅沒藥烯（8.50%）；L4 的主要成分包括石竹烯（20.3%）、檀香醇（16.9%）、氧化石竹烯（7.88 %）；B1 的主要成分包括檀香醇（31.90%）、順式-α-檀香（19.07%）、α-檀香醇（9.51%）、β-紅沒藥醇（3.41%）、α-紅沒藥醇（3.26%）；B2 的主要成分是檀香醇（29.35%）、順式-α-檀香（14.56%）、α-檀香醇（13.18%）。

3.2 聚類分析

通過GC-MS 的分析結果可以看出黃皮葉L1，L2，L3，L4 和樹皮B1，B2 的揮發油的主要成分及含量存在一定的差異性，為更好地區分不同產地黃皮葉及樹皮揮發油成分及含量的差異，且與之后的抑菌效果相關聯，本研究根據揮發油的主要化學成分和含量采用SPSS 17.0 對6 種揮發油進行聚類分析，聚類結果見圖2。

圖2 黃皮葉和樹皮揮發油基于化學成分及含量的聚類圖Fig.2 Dendrograms based on the chemical components and contents of Clausena lansium leaves and barks

從圖2 中可以看出，首先所有揮發油被分為2 類：L2、L3、L4、B1、B2 一類，L1 一類，說明 L1 與其他揮發油差異最大，最終將其分為3 類，其中化學型Ⅰ：L2、L3、L4，為檀香醇和石竹烯型，該類中有均為黃皮葉；化學型Ⅱ：B1、B2，為檀香醇和順式-α-檀香醇型，均為黃皮樹皮，說明黃皮葉和樹皮的揮發油成分及含量具有一定的差異，推測這與其部位不同有關；化學型Ⅲ：L1，石竹烯和β-紅沒藥烯型，3 種化學型的主要成分及含量見表4。

3.3 抑菌試驗結果

按照“2.4”的方法所得結果見表5。

由表 5 可知，黃皮葉揮發油（L1～L4）均具有較強的抑菌活性，其中L1 對所有受試菌均表現較好的抑菌效果，抑菌圈的直徑范圍為9.3 mm～14.2 mm，為低敏感到中度敏感，且對Ca 27 耐藥菌也具有一定的抑菌作用；L2、L3、L4 則僅對 Ck、Ct、Cg 3 種菌株有抑菌活性，抑菌圈的直徑范圍為8.1 mm～12.2 mm，為低敏感到中度敏感，對Ca、Cp 不敏感，而黃皮樹皮揮發油則對受試菌均無抑菌效果。

表4 3 種化學型的主要揮發性成分的差異Table 4 Variation of some important volatile components of Clausena lansium in three chemotypes

表5 黃皮葉和樹皮揮發油的抑菌試驗結果（）Table 5 Antifungal activity of essential oil from Clausena lansium leaves and barks（）

表5 黃皮葉和樹皮揮發油的抑菌試驗結果（）Table 5 Antifungal activity of essential oil from Clausena lansium leaves and barks（）

假絲酵母菌種類抑菌圈/mm L1 L2 L3 L4 B1 B2 氟康唑Ca ATCC 10231 9.3±0.12 0 0 0 0 0 31.7±0.06 Cp ATCC 22019 10.0±0.05 0 0 0 0 0 27.1±0.07 Ck ATCC 6258 13.9±0.03 11.8±0.05 9.9±0.11 10.0±0.04 0 0 15.4±0.06 Ct CMCC（F）c2f 9.6±0.02 8.5±0.11 8.1±0.06 8.2±0.05 0 0 31.3±0.02 Cg CMCC（F）c6e 14.2±0.08 11.8±0.10 12.2±0.12 9.7±0.09 0 0 23.6±0.06 Ca 27 9.7±0.13 0 0 0 0 0 0 Ca 53 10.4±0.09 0 0 0 0 0 30.1±0.01

4 討論與結論

4.1 不同產地黃皮葉及樹皮揮發油成分和含量的差異

在以往研究中，羅輝等[9]從廣東湛江產黃皮葉揮發油中鑒定出24 個成分，主要成分為順-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3 醇即橙花叔醇（16.68%）、β-石竹烯（11.78%）；Zhao J 等[10]從海南昌江產黃皮葉揮發油中分析鑒定了32 個成分，主要成分為β-檀香醇（35.2%）、紅沒藥醇（13.7%）；Pino J 等[11]從古巴產黃皮葉揮發油中鑒定70 個成分，主要成分為石竹烯氧化物（16.8%）和（Z）-α-檀香醇（11.7%）；唐冰等[12]從廣西產黃皮葉揮發油中共鑒定了44 個成分，主要成分為2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）-二環[3.1.1]庚-2-烯即 α-香檸檬烯（22.25 %）、石竹烯（14.29%）、（S）-1-甲基-4-（5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基）-環己烯即紅沒藥烯（12.35%）、β-水芹烯（9.56%）等。本研究從海南黃皮葉揮發油中鑒定出的總化學成分均為50 個左右，含量較高的成分有的和之前文獻報道的相似，例如石竹烯、檀香醇等，但主要成分及其含量仍存在一定的差異，這可能與黃皮所處地理位置，生長環境，采摘時間等不同有關。在以往文獻中筆者未見黃皮樹皮揮發油的研究報道，本研究分析鑒定了黃皮樹皮揮發油的主要成分均為檀香醇（31.90%，29.35 %）、順式-α-檀香（19.07%，14.56%）、α-檀香醇（9.51 %，13.18%），兩個產地差異不大。

4.2 黃皮葉及樹皮揮發油成分與抗假絲酵母菌活性的相關性研究

根據海南不同產地的黃皮葉及樹皮的揮發油成分及其抗假絲酵母菌活性的綜合分析，發現6 種揮發油的抑菌活性強弱與化學成分具有一定的關系，抑菌活性由強到弱為：化學型Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。化學型Ⅲ即L1 的抑菌作用最強，其中含有高含量的石竹烯、β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯和黑蟻素，化學型Ⅰ即 L2、L3、L4 的抑菌作用次之，其中含有高含量的檀香醇、石竹烯和氧化石竹烯，化學型Ⅱ即B1、B2 無抑菌作用，其中含有高含量的檀香醇、順式-α-檀香醇和α-檀香醇，化學型Ⅲ與其他兩種化學型主要成分的差異在于其含有高含量的β-倍半水芹烯和黑蟻素，由此推測β-倍半水芹烯和黑蟻素有可能具有較強的抗假絲酵母菌活性作用，而檀香醇類及石竹烯類化合物無抗假絲酵母菌作用或作用較弱，但是抗菌活性強弱可能并不完全取決于主要化學成分，其他含量較小的化學成分也可能具有抗菌活性或者不同成分具有協同作用，因此還需對含量較高的幾種成分單獨或者聯合進行抑菌試驗，以期進一步闡明黃皮抗假絲酵母菌活性的作用及機制，為其開發成為新的高效、廣譜、低毒、價廉的抗真菌藥物提供依據。

總之，本研究采用GC-MS 分析檢測了海南不同產地的黃皮葉及樹皮的揮發油成分，并按照其成分及含量聚類分析為3 個化學型，與紙片法測得的對5 種假絲酵母菌的抑菌活性具有一定的相關性，這為進一步研究海南產黃皮的抗真菌藥用價值提供了試驗依據。