胃癌患者血漿miR-216a表達及其對胃癌細胞惡性生物學行為的調控作用

任娟，余青龍，卞西杰，張幫柱，曾安貴

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，手術治療、放化療等用于胃癌的治療使患者的預后得到了一定改善，但受到局部腫瘤復發、淋巴結轉移、遠處器官轉移等因素的影響，胃癌患者的整體生存情況并不樂觀[1-2]。目前，胃癌的發病機制仍未闡明，進而也限制了靶向治療藥物的研發。微小RNA(miRs)是一種在轉錄后水平調節基因表達的小分子RNA，通過調節靶基因的表達來介導相應的生物學作用。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多項細胞研究中被證實能夠抑制肺癌細胞、腎癌細胞、骨肉瘤細胞等惡性腫瘤細胞的增殖[3-5]。有研究報道胃癌病灶內miR-216a的表達明顯下調[6]，提示miR-216a可能在胃癌的發生發展中起到抑癌作用。本研究首先分析了胃癌患者血漿miR-216表達的變化，進一步以胃癌細胞為實驗對象分析了miR-216a對胃癌細胞惡性生物學行為的調控作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年3月—2018年12月攀枝花學院附屬醫院普外科診治的胃癌患者和同期于醫院體檢健康志愿者。胃癌患者均經病理學診斷且確診時均接受過放化療、生物治療、免疫治療等抗腫瘤治療，既往無其他惡性腫瘤病史。胃癌患者38例(胃癌組)：男22例，女16例，年齡39～61(45.67±8.23)歲；健康志愿者(健康組)50例：男 31例，女19例，年齡35～58(44.85±8.51)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。 本研究經醫院倫理委員會審批通過，全部受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-216a測定 采集空腹肘靜脈血3 ml，以天根公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒和miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分離血漿miR并反轉錄合成cDNA，采用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的miR-216a進行擴增，根據擴增曲線計算miR-216a的表達水平[7]。

1.3 胃癌細胞增殖活力、信號通路測定

1.3.1 材料： 胃癌細胞株SGC-7901購自 Sigma公司，細胞培養所用DMEM、胎牛血清(FBS)、0.125%胰蛋白酶購自Hyclone公司，細胞增殖MTS檢測試劑盒購自Promega公司，蛋白裂解液購自Roche公司，miR-216a表達檢測所用試劑盒購自北京天根公司，基因mRNA表達檢測所用試劑盒購自北京康為世紀公司，PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的單克隆抗體及相應的第二抗體購自SantaCruz公司。

1.3.2 細胞培養及分組： 胃癌細胞株SGC-7901用含有10%FBS的DMEM處理，細胞融合至80%后用0.125%胰蛋白酶進行消化和傳代，傳代后的細胞分為miR-216a組(轉染miR-216a的模擬物)和陰性對照組(轉染NC的模擬物)。

1.3.3 細胞增殖活力檢測：轉染模擬物后6、12、18、24 h，向培養基中加入MTS試劑盒中的檢測液，繼續培養4 h，而后將培養板放置在酶標儀上，讀取450 nm波長處的吸光值，以此作為增殖活力值。

1.3.4 增殖基因mRNA表達檢測：轉染模擬物后24 h，采用康為世紀公司的超純RNA提取試劑盒和SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒分離細胞中的RNA并合成cDNA，采用UltraSYBR Mixture試劑盒對cDNA中的CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc基因進行擴增，根據擴增曲線計算基因的mRNA表達水平。

1.3.5 信號通路分子蛋白表達檢測：轉染模擬物后24 h，采用蛋白裂解液分離提取細胞中的總蛋白，高溫變性后將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺分離凝膠中，電泳分離蛋白后進行電轉膜，將分離凝膠中的蛋白樣本電轉移至NC膜后用5%脫脂牛奶對NC膜進行封閉，2 h后用PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的第一抗體對NC膜進行孵育，4℃過夜后取出，孵育第2抗體2 h。最后用ECL顯影系統顯示得到PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白條帶，根據條帶灰度值計算蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 2組血漿miR-216a表達比較 胃癌組血漿miR-216a表達為(0.64±0.10)，健康組為(1.02±0.18)，2組比較差異有統計學意義(t=11.703,P=0.000)。

2.2 2組胃癌細胞增殖活力值比較 轉染模擬物后6、12、18、24 h，miR-216a組的細胞增殖活力值明顯低于陰性對照組 (P<0.05)，見表1。

2.3 2組轉染模擬物對胃癌細胞中增殖基因表達比較 轉染模擬物后24 h，miR-216a組胃癌細胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表達水平均明顯低于陰性對照組(P<0.01)，見表2。

2.4 2組轉染模擬物對胃癌細胞中增殖信號通路蛋白表達比較 轉染模擬物后24 h，miR-216a組胃癌細胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表達水平均明顯低于陰性對照組(P<0.05)，見表3。

3 討 論

胃癌發病機制及靶向治療手段一直是消化道腫瘤領域的研究熱點。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多種惡性腫瘤細胞中均被證實能夠起到抑制細胞增殖、侵襲的作用，但關于miR-216a在胃癌中表達的變化及價值并未明確。為了明確miR-216a在胃癌發生發展中所起的作用，本研究首先對胃癌患者血漿中miR-216a表達的變化進行了分析，胃癌患者血漿中miR-216a的表達水平明顯低于健康志愿者，提示miR-216a的低表達與胃癌的發生有關，增加miR-216a可能是治療胃癌的潛在靶點。在此基礎上，本研究進一步以離體培養的SGC-7901胃癌細胞株為實驗對象，通過轉染miR-216a的模擬物來增加細胞內miR-216a的表達，進而探究miR-216a對胃癌細胞增殖的調節及增加miR-216a對胃癌的潛在治療價值。轉染模擬物6、12、18、24 h后，miR-216a模擬物均能使胃癌細胞的增殖活力明顯下降，提示miR-216a在胃癌發生發展過程中具有抑癌作用，增加miR-216a可能起到治療胃癌的作用。

miRs發揮生物學作用的方式是在轉錄后水平調節基因表達，通過基因表達的改變產生生物學效應。miR-216a作為具有抑癌特性的miR，能夠靶向抑制多種增殖基因的表達使增殖基因介導的促增殖作用減弱，進而發揮其抑癌作用。在胃癌發生發展過程中，CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc是已知的重要增殖基因。CyclinD1編碼的產物直接參與細胞周期進程的調控，能夠加速細胞周期、促進細胞有絲分裂[8]；Ki-67的編碼產物是一類核增殖抗原，在細胞核內參與DNA的復制并與細胞的增殖活力直接相關[9]；Bcl-2的編碼產物對線粒體內細胞色素C的釋放具有阻礙作用，通過阻礙細胞色素C釋放來增強細胞的增殖活力[10-11]；Gli1和c-myc是2種原癌基因，能夠通過多途徑誘導細胞惡變、促進細胞增殖[12-13]。本研究在轉染模擬物后24 h檢測了細胞中上述增殖基因表達的變化，miR-216a組胃癌細胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表達水平均明顯低于陰性對照組，表明miR-216a對胃癌細胞中多種增殖基因的表達具有抑制作用，進而提示靶向抑制增殖基因表達可能是miR-216a降低胃癌細胞增殖活力的分子途徑。

在癌細胞增殖過程中，增殖基因高表達后表達產物引起細胞增殖活力的改變涉及復雜的生物信號轉導。PI3K/AKT/mTOR信號通路和MEK/ERK1/2信號通路是與多種惡性腫瘤細胞增殖密切相關的通路。在PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活過程中，PI3K和AKT依次發生磷酸化并活化，進而引起mTOR發生磷酸化并啟動下游多種增殖基因的表達[14-15]。在MEK/ERK1/2信號通路的激活過程中，MEK首先發生磷酸化活化，引起下游MAPK家族中的多個成員發生磷酸化后進一步造成ERK1/2磷酸化活化，活化的ERK1/2能夠進入細胞核調節多種增殖基因的表達[16-17]。本研究在轉染模擬物后24 h檢測了細胞中上述信號通路分子磷酸化的程度，結果發現miR-216a組胃癌細胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表達水平均明顯低于陰性對照組，提示miR-216a對胃癌細胞中介導增殖的PI3K/AKT/mTOR信號通路和MEK/ERK1/2信號通路具有抑制作用，通過抑制信號通路的活化來起到抗癌作用。

表1 陰性對照組和miR-216a組細胞增殖活力值比較

表2 陰性對照組和miR-216a組細胞中增殖基因表達的比較

表3 陰性對照組和miR-216a組細胞中增殖信號通路蛋白表達的比較

綜上所述，胃癌患者血漿miR-216a的表達缺失，且增加miR-216a表達能夠抑制胃癌細胞的增殖，具體表現為miR-216a能夠靶向抑制多種增殖基因的表達及增殖信號通路的活化。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

任娟:進行實驗操作及論文撰寫；余青龍、張幫柱：臨床樣本收集；卞西杰：數據統計；曾安貴：論文審核與修改