在線固相萃取/液相色譜倉勢琢用法測定肝素類藥物生物效價

劉若男 朱黎 劉堂榮 鄒旋 許哲 管華詩

摘 要：利用酶催化反應，結合在線SPE/液相色譜質譜聯用分析系統，建立了一種通過定量酶反應過程測定生物效價的分析方法，用于評價肝素類藥物抗IIa因子效價和抗Xa因子效價。本方法采用在線C18柱富集純化樣品后，在另一根C18柱上，以水乙腈體系為流動相進行分離，并采用電噴霧正離子模式，以多反應檢測（MRM）方式進行定量分析。方法學考察結果表明，酶反應產物對硝基苯胺（pNA）在3～1000 μg/L濃度范圍內線性關系良好，方法的定量限為3 μg/L，準確度（相對回收率）為88.8%～100.6%，日內與日間精密度（相對標準偏差）分別為1.1%～5.4%（n=6）和3.8%～10.9%（n=18），無明顯基質效應。以肝素鈉標準品為對照品，測定了2個肝素鈉供試品的生物效價，均達到藥典標準要求。本方法較紫外分光光度法具有更好的靈敏度和良好的重現性，酶試劑及底物用量更少，可作為測定肝素類藥物生物效價的新方法，為肝素類藥物生產過程中的質量控制提供技術支持。

關鍵詞：質譜; 生物效價; 肝素; 在線固相萃取; 高效液相色譜

1 引 言

肝素（Heparin，HP）為硫酸糖胺聚糖類天然抗凝劑，具有預防血栓形成的作用[1]。盡管肝素在皮下給藥后能快速抗凝，而且相對便宜，但由于治療窗窄、長期使用產生血小板減少癥等限制，使得HP臨床使用時必須依據患者的凝血功能指導用藥[2]。雖然研究者已深入探究了肝素結構和生物活性的關系[3～5]，但由于肝素抗凝活性的結構基礎尚未完全揭示，因此，生物效價的測定成為肝素類藥物質量評估的重要指標，用于反映肝素類藥物的抗凝活性[6]。目前，肝素活性主要通過測定活化部分凝血活酶時間（APTT）、激活凝血時間（ACT）和凝血酶原時間/國際標準化比率（PT/INR）等指標反映[7]。這些傳統的抗凝活性測定方法靈敏度較低，儀器、試劑和操作人員的變化都會對結果產生影響。相較于傳統凝血測試，血栓彈力圖（TEG）[8，9]和凝血活酶生成測定（TGT）[10]在監測肝素活性時靈敏度更高。目前，TEG各監測指標的參考值尚未完全統一，儀器之間的差距較大，需要針對不同分析儀設定基線值[11]。TGT測定則缺乏標準化操作流程和評估指南。血栓形成測試以血塊生長速率表征凝血程度，為抗凝檢測提供了標準化的測試方法[12]。以上這些方法均需要使用血漿等可能引入誤差的生物制品，給出的是多種抗凝反應的綜合結果，無法對實際造成凝血障礙和出血副作用的主要病理機制進行確認[13]。近年來，一些醫療機構嘗試通過測定單個凝血因子的抗凝活性監測肝素類藥物用藥[14，15]。現行2015版《中國藥典》二部中肝素鈉的效價測定采用紫外可見分光光度法，針對單一凝血因子效價（抗IIa因子和抗Xa因子效價）進行分別測定[16]。藥典方法需要使用大量價格昂貴的試劑，如各類酶制劑，導致測試成本較高。此外，樣品基質的干擾對該方法的結果準確性影響較大。鑒于此，有研究者采用熒光法取代紫外法[17，18]， 提高了檢測靈敏度，避免了樣品背景的干擾，但在高濃度時，無法避免自身熒光的影響。

測定效價過程用到的試劑較多，成分復雜，為了排除背景基質的干擾，可以通過引入各種分離技術進行效價測定，如體積排阻色譜等[19]。但是，進行色譜分析前必需進行必要的樣品前處理操作，從復雜樣品基質中提取、凈化、分離和富集目標物，提高檢測結果的準確性和可靠性，防止污染分析儀器。傳統的樣品前處理方法多采用離線方式，如液液萃取、固相萃取（SPE）、QuEChERs法等，大多步驟繁瑣、費時費力，溶劑消耗大。在線固相萃取是類似于二維液相色譜的樣品前處理方法，通過柱切換分別進行樣品純化和分離分析，實現了全自動前處理，減少了分析時間及溶劑消耗，并避免人為因素引起的誤差，有效提高了檢測的準確性。在線SPE/液相色譜質譜聯用系統一般包括兩個獨立的色譜泵，6位/10位柱切換閥及在線SPE柱和分析柱。近來，在線固相萃取技術在生物醫藥、食品和環境領域的應用已多有報道[20～24]。

肝素主要的抗凝作用是通過增強抗凝血酶III（AT Ⅲ）這類絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性以及酶抑制劑復合物的穩定性而實現的。肝素糖鏈與AT Ⅲ的結合會引起AT Ⅲ局部構象發生改變，從而與凝血因子特別是凝血酶（IIa因子，FIIa）和凝血因子Xa（Xa因子，FXa）結合，形成HPATIIIIIa因子及HPATIIIXa因子三元復合物，抑制凝血因子的功能，起到抗凝的效果。此時，游離的IIa因子和Xa因子仍具有活性，可以水解其相應的特異底物[25]。本研究利用在線SPE/液相色譜質譜聯用分析系統，通過定量IIa因子和Xa因子參與催化的酶反應過程測定生物效價，不需要使用血漿等生物制品，符合國際上盡可能用理化分析方法代替生物測定的趨勢。本方法可用于肝素類藥物抗IIa因子效價和抗Xa因子效價的檢定，為生產和臨床使用中肝素的質量評估提供了新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1290 Infinity Value Drive（G1170）二位十通閥、1260 Infinity II泵和1290 Infinity II6460 Triple Quad UHPLC/MS 高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀（美國Agilent公司）; Spectra MAX190 型酶標儀（美國 Molecular Devices 公司）; Thermo Micro 21R低溫超速離心機（美國Thermo公司）; HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）; 十萬分之一天平（梅特勒托利多集團）; pH 4000 基礎酸度計（上海安萊立斯儀器科技有限公司）; 渦旋混合器（德國艾卡公司）。

IIa因子（EC 3.4.21.5; 5 IU/mg）、Xa因子（EC 3.4.21.6; 0.25 IU/mg）、抗凝血酶III（1 IU/mg）、顯色底物S2238和S2765（北京艾德豪克國際科技有限公司）; 肝素鈉標準品： 批號150509200912，標示效價為 197 IU/mg（中國食品藥品檢定研究院）; 肝素鈉供試品（東營天東生化工業有限公司）; 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、對硝基苯胺（pNA）和N甲基對硝基苯胺（上海阿拉丁化學有限公司）; 甲酸（美國SigmaAldrich公司）; 乙腈、甲醇（LCMS級，德國Merck公司）; 雙蒸水（香港屈臣氏基團有限公司）; 其它試劑均為分析純。

2.2 溶液配制

三羥甲基氨基甲烷聚乙二醇（PEG）6000緩沖溶液（pH 8.4）的配制： 分別稱取Tris 6.06 g，NaCl 10.23 g，乙二胺四乙酸二鈉 2.8 g，PEG 6000 1.0 g，加水溶解，以HCl調節至pH 8.4，加水定容至1000 mL。

肝素鈉標準品（S）溶液： 稱取肝素鈉標準品適量，按相鄰高濃度與低濃度的劑量比1∶0.5加入TrisPEG 6000緩沖溶液，分別配制0.04 IU/mL（S1）、0.02 IU/mL（S2）、0.01 IU/mL（S3）和0.005 IU/mL（S4）4個不同濃度的肝素鈉標準品溶液。

肝素鈉供試品（T）溶液： 肝素鈉供試品預估效價為200 IU/mL，按與標準品溶液同樣的劑量比1∶0.5加TrisPEG 6000緩沖液，分別配制成0.04 IU/mL（T1）、0.02 IU/mL（T2）、0.01 IU/mL（T3）和0.005 IU/mL（T4）4個不同濃度的肝素鈉溶液。

酶溶液： 用TrisPEG 6000緩沖液配制酶溶液，抗凝血酶III、IIa因子、Xa因子的濃度分別為0.005、0.01和0.005 IU/mL。

底物溶液： 用水分別配制0.15 μmol/L的S2238和S2765溶液。

pNA儲備液： 稱取4.0 mg pNA標準品，用50%（V/V）乙腈溶液定容在100 mL棕色容量瓶中，于4℃保存，備用。

標準工作溶液： 準確移取適量pNA儲備液，分別配制1、3、5、25、50、100、200、500和1000 μg/L的pNA溶液，各加入等體積的50 μg/L內標物（ISTD）N甲基4硝基苯胺，混勻備用。

pNA質控樣品： 將上述pNA儲備液用水稀釋成相應濃度，配制質控樣品，用于方法學驗證。質控樣品包括低濃度質控（5 μg/L）、 中濃度質控（50 μg/L）和高濃度質控（500 μg/L）樣品。

2.3 液相色譜質譜方法

在線固相萃取與液相色譜質譜聯用系統如圖1所示。

在線固相萃取條件： ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（A， 12.5 mm×4.6 mm， 5 μm， 安捷倫公司），清洗流動相對應泵A流動相，組成為0.5%甲酸乙腈（9∶1， V/V），等度洗脫，流速為0.6 mL/min。

色譜分離條件： Poroshell 120 EC C18色譜柱（B，50 mm×2.1 mm， 2.7 μm，安捷倫公司）為分析柱，流動相為水乙腈（4∶6， V/V），等度洗脫1.8 min; 流速為0.4 mL/min; 進樣量為2 μL; 柱溫35℃。

電噴霧質譜（ESIMS）條件： 正離子模式; 碎裂電壓： 90 V; 干燥氣溫度： 350℃; 霧化器壓力： 2.76×104 Pa; 干燥氣流速： 10 L/min; 毛細管電壓： 4000 V; 采用多重離子監測模式（MRM）進行定量分析，pNA定量離子對： 母離子m/z 139.1，子離子m/z 122.0，碰撞能量（CE）為13 V; ISTD定量離子對： 母離子m/z 153.1，子離子m/z 136.0，碰撞能量（CE）12 V。

參照近年來在線樣品前處理技術報道[26～28]，本研究在一套商品化的高效液相色譜質譜聯用儀基礎上，通過一個十通閥將另一個液相色譜泵與之相連，并配兩根色譜柱（色譜柱A和色譜柱B），實現對效價反應體系樣品的在線固相萃取和分析，包括以下3個步驟： （1）裝載和清洗 六通閥（閥A）處于虛線連通位置，自動進樣器將待分析樣品注入閥A的定量環中; 然后閥A切換至實線位置，定量環中的樣品隨泵A流動相流入色譜柱A（在線SPE柱）中，其中效價反應體系中洗脫下來的蛋白和鹽類等物質經閥A最后進入廢液，而pNA和內標物（ISTD）被保留在在線SPE柱中，清洗時間為1.2 min; （2）洗脫和分離 1.2 min后，切換閥A和閥B至虛線連通位置，色譜柱A和色譜柱B（分析柱）串聯連接，泵B流出的流動相水乙腈（4∶6，V/V）以流速0.4 mL/min等度洗脫1.8 min。在線SPE柱上保留的目標物pNA和內標物被洗脫到分析柱上并進行分離和質譜檢測; （3）平衡 待樣品分析完成后，閥A和閥B切換至實線位置， 系統平衡1 min，切換閥A重新至進樣位置，則重新進樣，依此循環至所有樣品分析完成。

2.4 肝素生物效價的測定

2.4.1 抗IIa因子 將肝素鈉、IIa因子溶液和底物（S2238）溶液提前孵育在37℃的水浴鍋中。參考藥典方法[16]，構建抗IIa因子效價反應體系?？笽Ia因子效價反應體系由肝素鈉、AT Ⅲ、FIIa以及底物S2238組成，在合適的條件下反應生成pNA?？瞻卓笽Ia因子效價反應體系指未加入底物S2238的上述化合物的混合物。取25 μL不同濃度的肝素標準品（S）和供試品（T），按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的順序分別加入到96孔板中，然后依次在每孔中加入25 μL的AT Ⅲ，混勻后放置2 min。隨后每孔加入50 μL IIa因子，混勻后放置2 min，再加入50 μL S2238，混合振蕩。5 min后， 加入150 μL乙腈淬滅反應，取出100 μL淬滅后的反應液與100 μL內標物混合，經0.22 μm濾膜過濾后直接進行LCMS分析，計算pNA濃度。

2.4.2 抗Xa因子 抗Xa因子效價反應體系由肝素鈉、ATⅢ、Xa因子以及底物S2765組成，在合適的條件下反應生成pNA?？瞻卓筙a因子效價反應體系指僅未加入底物S2765的上述化合物的混合物。步驟同2.4.1節所述，使用底物S2765和Xa因子分別代替抗IIa因子效價反應體系中的底物S2238和酶IIa因子，建立抗Xa因子效價反應。

2.4.3 計算方法與結果評定 使用肝素鈉標準品，按照生物檢定統計法（中國藥典2015年版第三部通則）[29]中的量反應平行線原理4×4法，以pNA濃度值為縱坐標，標準品系列溶液（或供試品系列溶液）濃度的對數值為橫坐標， 分別做線性回歸，計算效價及實驗誤差?？煽啃詸z測結果： 回歸應p<0.01， 偏離平行應p >0.05，二次曲線應p >0.05，反二次曲線應p >0.05，認為結果可靠。可信限率（FL，%）反映檢定結果的精密度。對于供試品，要求按干燥品計算，1 mg抗IIa因子的效價不得低于180 IU，抗Xa因子效價與抗IIa因子的效價比應為0.9～1.1。

3 結果與討論

3.1 在線前處理/液相色譜質譜聯用方法的建立

在線固相萃取系統的操作條件對樣品前處理的效果具有重要影響。為了保證在盡可能去除干擾的基礎上，獲得良好的分離度和峰形，首先對在線固相萃取系統的清洗流動相組成、洗脫時間及流速等條件進行優化。經過上樣步驟后，基質和目標化合物會一起吸附在SPE柱上，需要在目標化合物被洗脫前用合適的清洗流動相除去部分的干擾物。在所選用的ZORBAX Eclipse Plus C18柱上，適當提高清洗流動相中有機相的比例可以改善去除雜質的效果，然而若有機相比例過高， 會使pNA從SPE柱上被過早洗脫下來，造成目標化合物的流失。結果表明，使用0.05%甲酸乙腈（9∶1， V/V）作為清洗流動相，流速為0.6 mL/min時，去除酶反應溶液中的蛋白和鹽類等物質的效果較好，主要雜質可以在前1.2 min內基本除去，且可使pNA及內標物保留在SPE柱上。由此確定閥B切換使在線SPE柱與分析柱串聯的時間點為1.2 min。

考察了不同比例的水乙腈體系作為洗脫流動相的效果。

結果表明，采用水乙腈（4∶6，V/V）可以有效地將pNA和內標物從在線SPE柱上洗脫下來，同時該流動相條件也可以使pNA和內標物在分析柱上進行有效的分離（圖2）。目標化合物于在線SPE柱上的洗脫和分析柱上的分離串聯進行，有效簡化了分析步驟，減少了閥切換的次數，使得方法更為穩定可靠。

在優化的實驗條件下，對Xa因子和IIa因子催化的酶反應溶液進行了分析，結果如圖2所示。pNA和ISTD分別在1.93和2.14 min出峰，分離度和峰形良好。樣品經在線SPE柱處理后，有效減少了復雜樣品基質對質譜分析的影響。同時，采用 MRM 檢測的掃描模式進一步降低了雜質的干擾。

3.2 方法學驗證

3.2.1 標準曲線、線性范圍及定量下限 取2.2節配制的標準工作溶液進行在線SPE/LCMS分析，以pNA和內標的峰面積之比（I/I0）為縱坐標，pNA濃度為橫坐標，進行線性擬合和回歸分析，其中線性回歸權重系數為1/x2。結果表明，在3～1000 μg/L濃度范圍內，I/I0與反應產物pNA濃度具有良好的線性關系，相關系數（r）為0.9995，線性方程為y=0.277x+0.003。根據10倍信噪比計算pNA的定量下限（LLOQ）為3 μg/L。

3.2.2 特異性 在優化的在線固相萃取、色譜分離和質譜檢測條件下，分別分析抗IIa因子和抗Xa因子的空白效價反應體系，考察方法的特異性。從圖3可見，空白抗IIa效價反應體系和空白抗Xa因子效價反應體系中未檢出干擾pNA檢測的信號。

3.2.3 準確度和精密度 分析方法的準確度用于描述測得值與分析物標示濃度的接近程度。精密度用于描述重復測定結果的接近程度。取低、中、高3種不同濃度的質控樣品分別連續進樣6次，進樣時確保濃度從低至高，測定對應峰面積的相對標準偏差，用于表征方法的日內精密度。將3個濃度的樣品，每天檢測6次，連續檢測3天，獲得方法的日內精密度。方法的精密度和準確度結果見表 1。 pNA分析方法的日內與日間精密度分別為1.1%～5.4%和3.8%～10.9%， 準確度為88.8%～100.6%。方法的準

確度和精密度均符合藥典要求。

3.2.4 基質效應 質譜作為定量分析檢測手段時，離子化時基質中的一些物質會與目標化合物發生競爭，使得目標化合物的離子化效率增加或降低，從而導致其響應值的提高或降低。通過比較等濃度pNA在空白效價反應基質與緩沖液中的響應值評價基質效應。在由酶（IIa因子、Xa因子和AT Ⅲ）、緩沖鹽溶液和肝素混合組成的空白效價反應溶液中按質控樣品的低、中、高3個濃度水平加入pNA標準品，與其對應的質控樣品比較（表1）。空白效價反應基質的基質效應在89.9%～96.9%之間，說明本方法中空白效價反應溶液對pNA定量及效價檢定影響較小，在可接受的范圍內。

3.2.5 穩定性 考察了經乙腈淬滅并等體積添加內標物后的效價反應溶液在不同條件下的穩定性，結果見表2。3個濃度水平的樣品在室溫放置12 h、Symbolm@@4℃下保存24 h以及48 h內進行3次凍融循環（Symbolm@@20℃和室溫）后，測得pNA的濃度與新配制的相應濃度質控樣品的比值在102.1%～109.1%之間，相對標準偏差在1.8%～12.3%之間，表明不同條件存儲后pNA未明顯變化，pNA在效價反應體系中具有良好的穩定性。

3.3 測定肝素鈉供試品生物效價

肝素類藥物結構復雜，其活性不能用單純的重量單位描述，需要以藥典對照品的活性為參照，獲得標準化的活性單位，從而保證病人的用藥劑量在使用不同來源藥品時保持一致。2015年版《中國藥典》三部收載1431生物鑒定統計法[29]，其中一種方法為量反應平行線法。量反應是指藥物對生物體所引起的反應隨著藥物劑量的增加產生的量變可以測量者。量反應平行線測定法要求在一定劑量范圍內，生物檢定標準品（S）和供試品（T）的對數劑量和反應或反應的特定函數呈直線關系，當S和T的活性組分基本相同時，兩直線平行。按照上述方法對兩個肝素鈉供試品進行生物效價的測定，結果如圖4所示，肝素鈉供試品和肝素鈉標準品的產物產生量和肝素濃度的對數值的曲線基本呈平行線。采用本方法，以肝素鈉標準品（150509200912）作為對照，利用量反應平行線原理4×4法計算供試品效價，結果見表3。供試品1的抗IIa因子效價和抗Xa因子效價分別為196.06和196.05 IU/mL，供試品2的抗IIa因子效價和抗Xa因子效價分別為195.92和196.07 IU/mL。另外，對于實驗數據用量反應平行線4×4法進行統計學分析，效價的可信限率（FL，%）均小于10%，且回歸顯著（p<0.01），偏離平行、二次曲線，反向二次曲線偏差均不顯著（p>0.05），說明檢定結果可靠。文獻＼[30＼]報道肝素的抗Xa因子與抗IIa因子的效價比≈1。本方法測定的兩個肝素鈉供試品的抗Xa因子效價與抗IIa因子的效價比均為1.00，與文獻＼[30＼]報道的結果一致。按照美國藥典收載的肝素鈉質量標準的相關要求，兩個肝素鈉供試品的抗Xa因子效價與抗IIa因子效價的比值在0.9～1.1范圍內。肝素鈉效價按干燥品計算1 mg活性需大于180 IU。本方法測定的兩個肝素鈉供試品的生物效價指標符合藥典標準。綜上，本研究開發的基于在線固相萃取/液相色譜質譜聯用分析測得肝素鈉生物效價的方法是準確可行的。

3.4 與藥典方法[16]的比較

將本方法與2015版《中國藥典》二部中肝素鈉效價測定中抗IIa因子和抗Xa因子測定方法進行了對比。結果表明，本方法中酶和底物的用量減少，節省了檢測成本; 在線固相萃取操作簡單，可實現自動化，減少了人為操作帶來的誤差; 在線SPE色譜柱可以多次使用，降低了成本。

4 結 論

建立了在線固相萃取/液相色譜質譜（online SPE/LCMS）聯用方法，用于肝素類藥物生物效價的測定方法。本方法直接分析經稀釋過濾的IIa因子和Xa因子的酶催化反應溶液，靈敏度高，樣品無需進行前處理，操作簡單快捷，靈敏度高，方法重現性好，并獲得了較好的準確度和精密度。系統的方法學考察表明， 本方法可滿足肝素鈉生物效價測定的分析要求，為生產中肝素鈉的質量評估提供了新方法。

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